Идентификация и изучение нового стресс-респонсивного гена Hi95

• Автор: Буданов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил

1.1 Гипоксия Индуцированный Фактор 1 НПМ и его роль в клеточных процессах.

1.1.1 Обнаружение Н ГР

1.1.2 Структура НПМ.

1.1.3 Семейства НШа и АКИТбслков.

1.1.4 Регуляция стабильности и активности НИМ при гипоксии.

1.1.5 Транскрипционные мишени Н1Р1.

1.1.6 НИМ независимые гены, активируемые гипоксией

1.2 р интегратор сигналов от различных стрессов. Роль р в ответе на гипоксию.

1.2.1 Структура и регуляция р.

1.2.2 Акгивация р в ответ на стресс.

1.2.3 Транскрипционные мишени белка р

1.2.4 Роль р при гипоксии.
1.3 Гены семейства вАЕЮ.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Использованные клеточные линии, их культивирование и обработка.
2.2. Плазмиды.
2.3. Норзерн блот анализ
2.4. Вестерн блот анализ
2.5. Приготовление проб и их гибридизация на кДНК микроаррес.
2.6. Транзиторная трансфекция клеток 3.
2.7. Эксперимент на колонисобразование.
2.8. Получение клеточных линий экспрессирующих требуемый ген в ретровирусном векторе
2.9. Окраска клеток метиленовым синим
2 Измерение клеточной гибели.
2 I i гибридизация.
2 Модель индуцированного инсульта среднего мозга.
2 Получение компетентных клеток .i и трансформация.
2 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой и щелочной фосфатазой.
2 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
2 Реакция лиг ирования.
2 Измерение активности люциферазы
2 Иммунофлюоресценция
2 Окраска клеток на Ргалактозидазу
2 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Клонирование и анализ нуклотидной и белковой последовательности нового гена i
3.2. Гипоксия индуцирует i мРНК i vi и i viv в различных типах клеток.
3.3. индуцируется в ответ на ДНКповреждеиия по рзависимому
механизму
3.4 Ген активируется в ответ на окислительный стресс, но не в ответ на
тепловой шок или сывороточное голодание
3.5. Экспрессия вызывает подавление пролиферации различных клеточных линий
3.6. Получение линии МСР7 с тетрациклинрегулируемой экспрессией гена
3.7. Белок, продукт гена локализуется в цитоплазме, но переходит в ядро
при некоторых видах стресса
3.8. Индукция экспрессии гена супрессирует рост клеток МСБ
3.9. Индуцибельная экспрессия вызывает апоптоз в клетках МСБ7, но не
влияет на клеточный цикл.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЯ
5. ВЫВОДЫ
6. БЛАГОДАРНОСТИ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЯ.
А.о. аминокислотный остаток
БСА бычий сывороточный альбумин
ДТТ дитиотрейтол
ОТ обратная транскрипция
ПЦР полимеразная цепная реакция
ЭДТЛ этилендиаминтетрауксусная кислота
додсцилсульфат натрия
сигнал ядерной локализации
ФСБ фосфатносолевой буфер
р белок р дикого типа
ИО ионизирующее облучение
УФ улыафиолетовое облучение
ЭТС эмбриональная телячья сыворотка
ДФО деффероксамин мезилат
ОРТ открытая рамка трансляции
РЭ респонсивный элемент
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
среда ЛуриаБсртани
I1 xii
i ixix
, и I домен

I1 ii i
ТАД трансактивационный домен
xi i
V v ii i
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


Гипоксия кислородное голодание и ДНКповреждения два вида стресса, тесно связанные с опухолеобразованием, а также со многими другими патологиями. Изучение механизмов клеточного реагирования на эти стрессы является областью активных научных исследований и обещают в будущем новые подходы к предотвращению и лечению рака, инсульта, инфаркта миокарда и многих других. Обнаружение I1 Еще в году было обнаружено, что уровень эритроцитов в крови повышается при понижении парциального давления атмосферного кислорода. Но только через 0 лет был выяснен механизм регуляции эритропоэза, после того, как был выделен и охарактеризован белок эригропоэгин, ответственный за активацию пролиферации и дифференцировки эритроидных предшественников при их превращении в эритроциты ii , . Следующем шагом было обнаружение, что геи эритропоэтина индуцируется воздействием гипоксии в клетках печени. Было выдвинуто предположение о существовании некоего сенсора кислорода, включающего в качестве компанента гемовое железо, и требующего белкового синтеза v . Также было обнаружено, что подавление дыхательной цепи при кислородном голодании само но себе не вызывает активации транскрипции гена эритропоэтина. В 3фланкирующей области гена эритропоэтина был обнаружен участок, ответственный за транскрипционную активацию этого гена в ответ на гипоксию, был обнаружен также белок, связывающийся с этой последовательностью в условиях гипоксии , . Б подтверждение этой гипотезы было обнаружено, что I1 участвует также в индукции под действием гипоксии целого ряда генов не связанных с эритропоэзом . После выделения гена I1 и его характеризации была подтверждена его способность регулироваться под действием гипоксии . Структура I1 Транскрипционный фактор 1 является одним из ключевых и довольно детально изученных транскрипционных факторов, индуцирующихся в ответ на гипоксию и меняющих экспрессию множества генов, вовлеченных в гомеостаз кислорода, ангиогенез, эри гропоэз, расширение сосудов, а также в регуляцию клеточного цикла и апоптоза у млекопитающих ii , . Он состоит из двух субъединиц, I. I с молекулярной массой 0 кД и кД, соответственно. Анализ аминокислотной последовательности показал, что обе субъединицы относятся к семейству белков i ixix назван по акронимам трех первых белков, в которых он был идентифицирован , и I. I идентичен белку . Субъединица I экспрессируется постоянно, но I1 а индуцируется под действием гипоксии, причем величина индукции пропорциональна снижению концентрации кислорода во внешней среде ниже определенного порогового уровня 6 . Детальное изучение структуры НПМа, состоящей из 6 а. Напротив, делециоиный мутант I, содержащий и домены ак способен взаимодействовать с I с той же эффективностью, что и полноразмерный белок ак, но полученный комплекс лишен способности к связыванию ДНК. Взаимодействие между полноразмерными I и I субъединицами приводит к изменению конформации последней, что необходимо для приобретения ДНКсвязывающей активности I1. Напротив, делеционный мутант ак не вызывает заметных конформационных изменений I, и, соответственно, данный комплекс оказывается лишен способности к связыванию с ДНК. Данные результаты свидетельствуют также об участии Сконцевого участка I в белокбелковых взаимодействиях i . Помимо белокбелкового взаимодействия между субъединицами I и I для приобретения I субъединицей новой конформации требуется взаимодействие I с шапероном i i И i . Стабилизированный и активированный комплекс I1 связывается с последовательностью ДНК, содержащей консенсус II ii i i . Метилирование области в гена эритропоэтин нарушает способность II связываться с ДНК и активировать транскрипцию этого гена I . В Сконцевой половине I ак расположены участки, отвечающие за трансактивацию и регуляцию стабильности и активности белка . За трансактивацию отвечают два участка один включает последовательность ак концевой трансактивационный домен ТАД, другой последовательность ак Сконцевой трансактивационный домен ТАДС. Эти участки на 0 идентичны в I человека и мыши и каждая из них может работать как независимый трансактивационный домен.