Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II

• Автор: Рубцов, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Хромосомные транслокации, ассоциированные с онкологическими

ЗАБОЛЕВАНИЯМИ.

1.1.1. Незаконная рекомбинация.

1.1.2. История изучения механизмов незаконной рекомбинации.

1.1.3. Хромосомные транслокации и ассоциированные с ними заболевания

1.1.4. Семейства химерных белков

1.1.5. Геныпартнеры по хромосомным транслокациям и кластеризация точек

разрыва ДНК.
1.1.6. Механизм возникновения хромосомных транслокаций
1.1.7. Структура кластеров точек разрыва ДНК как предпосылка для образования
хромосомных транслокаций
1.2. Двухцепочечные разрывы ДНК и их репарация
1.2.1. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК
1.2.1. ДНКтопоизомераза II и ее функции в клетке.
1.2.2. Ингибирование ДНКтопоизомеразы II как причина образования
двухцепочечных разрывов ДНК
1.2.3. Ингибирование ДНКтопоизомсразы II как предпосылка для возникновения
хромосомных транслокаций
1.2.4. Гипотезы возникновения хромосомных транслокаций
1.3. Позиционирование хромосом в ядре и вероятность возникновения
хромосомных транслокаций
1.3.1. Хромосомные территории.
1.3.2. Пространственная близость хромосомных территорий способствует
образованию транслокаций
1.3.3. Перемешивание хромосомных территорий.
1.3.4. Современная модель организации хромосомных территорий
1.3.5. Релокализация геномных локусов внутри ядра. Роль ядерных моторных
белков в этих процессах
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1. Материалы
II. 1.1. Клеточные линии
II. 1.2. Антитела.
II. 1.3. Химические реактивы
II. 1.4. Программное обеспечение
.2. Методы.
П.2.1. Культивирование клеточных линий
П.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле.
П.2.3. Определение количества мертвых клеток
.2.4. Пммуноокрашивание
.2.5. Флюоресцентная гибридизация i i I.
.2.5.1. Приготовление двумерных препаратов фиксированных клеток
П.2.5.2. Выделение бакмидной ДНК из клеток .i.
И.2.5.3. Синтез пробы.
II.2.5.4. Гибридизация.
И.2.5.5. Приготовление трехмерных препаратов клеток
И.2.5.6. Гибридизация с пробой Vi
И.2.6. Компьютерная обработка изображений.
П.2.7. Статистический анализ данных.
И.2.8. Иммунопрсципитация хроматина.
.2.8.1. Растворы.
.2.8.2. Методика.
П.2.8.3. 1ТЦР в реальном времени с пробами.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Ш.1. Анализ взаимного расположения генов АМН и ЕГО в культуре первичных
ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
1.2. Ингибирование лигирующей активности ДНКтопоизомеразы И вызывает
ПЕРЕМЕЩЕНИЕ ГЕНА ЕГО В НАПРАВЛЕНИИ ЦЕНТРА ЯДРА.
1.3. Ингибирование ДНКтопоизомеразы II вызывает релокализацию гена ЕГО в
ОБЛАСТЬ ЯДРЫШКА
1.4. Ингибирование ДНКтопоизомеразы II приводит к предпочтительному связыванию нуклеолина с 2 гена ЕГО
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ .
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Она может происходить у эукариот как при образовании половых клеток гамет, так и в соматических клетках, у бактерий и даже в ходе размножения вирусов, в том числе таких, генетический материал которых состоит из РНК. Перетасовка хромосом в мейозе, приводящая к офомному разнообразию гамет, случайность слияния гамет при оплодотворении, обмен частями между гомологичными хромосомами все это относится к рекомбинации. Понятно, что из широкого круга рекомбинационных явлений интерес молекулярных биологов в первую очередь вызывает рекомбинация, заключающаяся в обменах частями между молекулами ДНК, ведь здесь можно применять весь арсенал методов генетики и молекулярной биологии, и эти исследования перекрываются с изучением других важных генетических процессов, прежде всего репликации и репарации ДНК. Но даже в таком виде, суженном до обменов частями молекул ДНК, понятие рекомбинация включает в себя большой набор разных по своей природе явлений. Незаконная рекомбинация это сборная группа процессов, в которых рекомбинация происходит между нсгомологнчпыми молекулами ДНК, и при этом, без участия механизмов сайтспецнфической рекомбинации или транспозиций. В качестве примеров можно привести захват ретровирусами некоторых клеточных генов при их эксцизии из хромосомы клеткихозяина, а также интеграцию фрагментов ДНК. Механизмы незаконной рекомбинации на сегодняшний день остаются мало изученными. Общим свойством для них является соединение концов негомологичных молекул ДНК. Впервые механизм одной из реакций незаконной рекомбинации был описан японским исследователем X. Икеда с сотрудниками в году . В опыте i vi эти авторы продемонстрировали рекомбинацию между полностью негомологичными ДНК плазмиды 2 и фага лямбда, катализируемую высокоочищенной ДНКтопоизомеразой II . ДНКгиразой. Согласно модели, предложенной авторами, две молекулы гиразы, каждая из которых состоит из двух пар субъединиц, временно разрывают обе цепи ДНК в обеих молекулах, удерживая их концы. Затем они обмениваются парами субъединиц вместе с удерживаемыми концами разных ДНКпартнсров и сшивают концы дуплексов. Позднее Икеда подтвердил свои наблюдения i viv в клетках . К настоящему времени накоплены данные об участии топоизомераз в незаконной рекомбинации у бактерий и эукариот. В последние десятилетия у амфибий и млекопитающих обнаружены ферменты, связывающие двухцепочечные концы ДНК независимо от их гомологии. Природа этих белков долгое время оставалась неясной. Но в х годах в результате исследований с использованием мутантов грызунов, проявляющих повышенную но сравнению с нормальными особями чувствительность к ионизирующим излучениям, был достигнут определенный прогресс i . i . . . Известно, что ионизирующие излучения вызывают двухцепочечные разрывы ДНК, то есть разрывы хромосом, для залечивания которых в нормальной клетке существуют специальные системы репарации. У мутантов они нарушены. Кроме того, у мутантов оказалась подавленной интеграция в хромосомы фрагментов ДНК, искусственно введенных в клетки. Это неудивительно, поскольку у млекопитающих процессы интеграции чужеродной ДНК, как и процессы репарации двухцепочечиых разрывов осуществляются преимущественно но механизму негомологичного соединения концов разорванных двухцепочечных ДНК, то есть посредством незаконной рекомбинации в отличие от дрожжей и бактерий, у которых они преимущественно основаны на гомологичной рекомбинации. Неожиданным оказался тот факт, что мутанты проявили неспособность к рекомбинационным перестройкам в кодирующих иммуноглобулины последовательностях ДНК, а это означало, что незаконная рекомбинация играет важную роль и в этих перестройках. Было выяснено, что в рекомбинации иммуноглобулиновых последовательностей ДНК задействованы два разных механизма. Ранние этапы образование сайтспецифических двухцепочечных разрывов происходят по типу сайтспецифической, а поздние воссоединение концов разрывов но механизму незаконной рекомбинации.