Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов

• Автор: Алексеев, Тимофей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Использование ЯМР спектроскопии на различных ядрах
1.2. Биосинтез белков, содержащих фтораминокислоты
1.3. I9F ЯМР исследования белков, содержащих остатки
фторароматических аминокислот
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а(1 -209)
и его мутант [Trp60Phe]-a( 1-209)
2.2. Фторсодержащие аналоги экстрацеллюлярного фрагмента а-субъединицы Torpedo californica a(l-209)F и его мутанта [Trp60Phe]-a(l-209)F
2.3. Две формы экстрацеллюлярного домена а-субъединицы
мышечного АХР человека
2.4. Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208)
и его мутант [Cysl 16Ser, Cysl90Ser, Cysl91Ser]-a(l-209)
2.5. Цитоплазматический фрагмент 8-субъединицы Torpedo californica 8(313-455)
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АХР - ацетилхолин-связывающий рецептор IPTG - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид NTA - нитрилотриацетоуксусная кислота DTT - дитиотриетол
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
aBgt - a-бунгаротоксин
КД - круговой дихроизм
ТФУ - трифторуксусная кислота
NDSB - сульфобетаин
NDSB-195 - диметилэтиламмонийпропансульфонат РСА - рентгеноструктурный анализ глифосат - Ы-(фосфонометил)глицин
1С5о - концентрация соединения, при которой происходит 50% ингибирование связывания лиганда Kd - равновесная константа диссоциации
MALDI MS - масс-спектрометрия с ионизацией посредством лазерной десорбции из матрицы SDS -додецилсульфат натрия ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
CHAPS - 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний-1-пропансульфонат м.д. - миллионные доли
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы являются лиганд-управляемыми каналами и подразделяются на две основные группы: рецепторы мышечного типа и нейрональные. Выводы о пространственной организации всего класса АХР до недавнего времени в значительной мере основывались на данных криоэлектронной микроскопии АХР мышечного типа, выделяемого в значительных количествах из электрического органа ската Torpedo californica [1]. Установлено, что субъединицы этого рецептора (две а- и по одной р-, у- и 6- субъединице) образуют пентамерный комплекс, вдоль оси которого располагается пронизывающий мембрану ионный канал (см. обзор [2]). Согласно существующим представлениям, каждая субъединица имеет экстрацеллюлярный домен, трансмембранный участок, а также цитоплазматический домен. К настоящему времени получена информация о форме трансмембранных фрагментов, выстилающих канал, а также об элементах вторичной и третичной структуры экстрацеллюлярного домена. Установление пространственной структуры более высокого разрешения с помощью РСА натолкнулось на трудности получения кристаллов цельного рецептора. В связи с этим представляется целесообразным провести вначале детальный структурный анализ отдельных функциональных доменов АХР.
В экстрацеллюлярном домене АХР происходит связывание ацетилхолина, а также различных других агонистов и антагонистов. Следует отметить, что экстрацеллюлярный домен а-субъединиц (или их фрагменты) были достаточно давно получены с помощью гетерологичной экспрессии в Escherichia coli, как правило, в виде тел включения. Изучение пространственных и функциональных характеристик этих белков требовало проведения их ренатурации. С помощью спектроскопии КД в ряде зарубежных лабораторий, а также в нашем институте была определена вторичная структура белков, отвечающих экстрацеллюлярному домену а-субъединиц мышечного АХР мыши и рецептора Т. californica, изучено ■ связывание этими доменами токсинов и моноклональных антител. При этом стало очевидно проведения оптимизации условий сборки белка, предотвращения образования агрегатов при достижении достаточно высоких концентраций белка, при которых возможно изучение пространственной структуры методом РСА или ЯМР.
Каждая субъединица АХР содержит достаточно протяженную цитоплазматическую петлю (100-150 аминокислотных остатков) между третьим и четвертым трансмембранными фрагментами. Цитоплазматическая петля играет большую роль в
2.3. Две формы экстрацеллюлярного домена а-субъединицы мышечного АХР человека.
Миастения (болезнь патологической мышечной утомляемости) - аутоиммунное заболевание, проявляющееся в нарушении нервно-мышечной передачи вследствие повреждения постсинаптической мембраны антителами к АХР поперечно-полосатых мышц. Многообразие клинических проявлений, неоднозначность оценки отдельных симптомов миастении, наличие сопутствующей патологии делает насущной проблему поиска новых дополнительных методов диагностики и контроля за эффективностью лечения миастении. Для количественного определения аутоантител сыворотки крови при миастении уже существуют иммуноферментные и радиоиммунологические методы. Однако в применяющихся ИФА наборах используется клеточная линия ТЕ671 [208], что увеличивает технические сложности получения и работы с такими препаратами. В радиоиммунологическом методе неудобство заключается в необходимости применения препарата [,251] меченного а-бунгаротоксина [209]. Задачей на этом этапе работы была попытка отказаться от применения радиоактивных изотопов, а также проверка возможности использования для определения уровня антител экстрацеллюлярного домена мышечного нАХР.
Плазмиды, кодирующие экстрацеллюлярный домен мышечного никотинового АХР человека были любезно предоставлены проф. А. Винсент (Институт молекулярной медицины, Оксфорд). Конструкция НЕ710 соответствует полноразмерному экстрацеллюлярному домену (остатки 1-209), HR710 - содержит дополнительный РЗА экзон. РЗА экзон кодирует дополнительные 25 аминокислотных остатка, расположенных между 58 и 59 аминокислотными остатками экстрацеллюлярного домена [210]. Данные конструкции содержат на N-конце лидерный пептид из 10 гистидинов и сайт энтэрокиназы.
После трансформации плазмидой клеток E.coli BL21(DE3) и добавления IPTG были получены белки следующего состава:
НЕ: MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHM-( <х-субъединица( 1-209 а.к.) ).
HR: MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHM-( а-субъединица(1-58 а.к.) )-РЗА-( а-субъединица(59-209 а.к.)).
Уровень экспрессии плазмид после добавления индуктора (IPTG) был выше 70%. Наличие вставки не оказало влияния на уровень экспрессии. В обоих случаях белки были получены в телах включения. После очистки тел включения, растворения в 8М мочевине и очистки HaNi-NTA-агарозе получили белки с чистотой более 90% (рис. 23).