Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот

• Автор: Попова, Анастасия Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 135 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вирусные заболевания культивируемых видов рыб

2.1.1. Семейство vii

2.1.1.1. Структура рабдовирусов

2.1.1.2. Особенности генома рабдовирусов рыб

2.1.2. Некоторые заболевания культивируемых видов рыб,

вызываемые рабдовирусами

2.1.2.1 Инфекционный некроз гемопоэтической ткани ИГТ

2.1.2.2. Вирусная геморрагическая еептицимия ВГС

2.1.2.3. Весенняя виремия карпа ВВК

2.1.3 Методы профилактики и лечения вирусных заболеваний рыб
2.2. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб
2.2.1. Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре
2.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот
2.2.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР и молекулярногенетический
анализ
2.2.3.1. Новейшие модификации метода ПЦР в диагностике
вирусных инфекций рыб
2.2.3.1.1. Мультиплексная ПЦР
2.2.3.1.2 ПЦР в реальном времени i
2.3. Генетическое типирование и филогенетический анализ
рабдовирусов рыб
2.3.1. Вирус геморрагической септицимии
2.3.2. Вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани
2.3.3. Вирус весенней виремии карпа
2. 4. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. 1. Материалы
3.2. Методы
3.2.1. Выделение вирусной РЫК
3.2.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК
3.2.3. Амплификация фрагмента гена VV
3.2.4. Полимеразная ценная реакция на кДНК вируса I
3.2.5. Анализ первичной структуры ДНК
3.2.6. Выравнивание последовательностей фрагментов генов
VV и IV и поиск сайтов рестрикции
3.2.7. Филогенетический анализ
3.2.8. Гидролиз фрагментов гена VV и IV эндонуклеазами
рестрикции ПДРФанализ
3.2.9. Штаммспецифичсское типирование VV
ПЦР с праймерами 1 v 2
3.2 Элюция из ПААГ фрагмента гена IV
3.2 Лигирование фрагмента гена IV с векторной ДНК
3.2 Подготовка компетентных клеток . i и трансфекция рекомбинантным бактериофагом М
3.2. Выделение формы фаговой ДИК и анализ клонов
3.2 Выделение однонитевой ДНК фага М
3.2 Мечение ДКзондагидроксисукцинимидным эфиром биотина
3.2 Гибридизация вирусной РНК с биотинилированными ДИКзондами
3.2 Выявление биотиповых групп на фильтрах
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Разработка методов выявления вируса весенней виремии карпа
VV на основе полимеразной цепной реакции
4.1.1. Амплификация фрагментов генома VСV
4.1.2. Определение специфичности и чувствительности выявления
РНК VV методом ОТпгПЦР
4.1.3. Эффективность выявления вируса V методом ОТпгПЦР в
полевых материалах от рыб
4.1.4. Определение эффективности метода ОТпгПЦР в ходе развития
инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб
4.1.5. Оценка эффективности выявления вируса V методом
ОТпгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации
4.2. Генетическое типирование изолятов VV
4.2.1. Разработка метода штаммспецифической ПЦР

4.2.2. Рестрикционный анализ фрагмента гена VV
4.2.3. Филогенетический анализ изолятов VV на основании
нуклеотидной последовательностифрагмента гена 5 пн
4.2.4. Тинирование вирусных штаммов в клинических материалах от рыб
с помощью рестрикционного анализа
4.3. Разработка методов выявления вируса инфекционного некроза
гемопоэтической ткани IV на основе гибридизационного анализа
4.3.1. Конструирование ДНКзонда для IV на основе ДНК фага М
4.3.2. Гибридизационный анализ
4.4. Разработка метода выявления вируса инфекционного некроза
гемопоэтичеекдй ткани с помощью ОТПЦР
4.4.1. Амплификация фрагментов генома IV
4.4.2. Определение чувствительности и специфичности выявления
РНК IV методом ОТпгПЦР
4.4.3. Определение эффективности метода ОТпг ПЦР в ходе развития
инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб
4.4.4. Тестирование клинических материалов от естественно
зараженных рыб
4.4.5. Оценка эффективности выявления вируса III методом
ОТпгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации
4.5. Генетическое тинирование изолятов IV
4.5.1. Генетическое типирование изолятов IV с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов Г1ДРФ
4.5.2. Филогенетический анализ некоторых изолятов IV
на основании нуклеотидной последовательности фрагмента
гена 0 пн
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ I
I
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Определение чувствительности и специфичности разработанных методов идентификации VV и IV в зараженной культуре клеток и в клиническом материале от инфицированных рыб. Разработка способов генетического типирования штаммов VV и IV на основании методов ПЦР и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПДРФ. Филогенетический анализ штаммов VV и IV на основе данных о нуклеотидной последовательности участков генов нуклсопротеина. IV позволяющие выявлять
вирусную I с высокой чувствительностью и специфичностью в препаратах культуральных вирусов и в клиническом материале от больных рыб. Способ генотипирования рабдовирусов рыб с помощью ПДРФанализа. Все исследуемые изоляты VV образуют пять генетических групп. Исследованные изоляты IV принадлежат к трем основным геногруппам , М и . Филогенетическое исследование участков гена нуклеоиротеина для восемнадцати изолятов VV и тринадцати изолягов II1V. Изоляты VV образуют генетические iiii в зависимости от географии их выделения. Камчатский изолят IV генетически близок североамериканским изолятам геногруппы , а
изоляты, выделенные в подмосковном регионе, образуют обособленную подгруппу в составе геногруппы . В результате проделанной работы на основе методов полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот впервые созданы тестсистемы для идентификации РНК вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтичсской ткани в инфицированных культурах клеток, в органах и тканях рыб. Разработаны методы генетического типирования изолятов указанных патогенов с помощью ПЦР и ПДРФанализа. Впервые проведен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротсина для российских и 6 европейских изолятов VV и показано их различие на генетическом уровне. Также выполнен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротсина для изолятов IV. Проведено сравнение изолятов, выделенных из естественных водоемов Камчатки и из форелевых рыбоводных хозяйств Московской и Тверской областей с изолятами, распространенными на Тихоокеанском побережье Северной Америки. По материалам диссертации опубликовано три статьи в реферируемых научных журналах и одна в книге Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Новосибирск, . Выделение препаратов РНК вирусов, конструирование ДНКзонда для IV на
основе ДНК фага М, мечение ДНКзонда гидрокисукцинимидным эфиром биотина, гибридизадионный анализ, выравнивание последовательностей фрагментов генов VV и IV, поиск сайтов рестрикции, ПЦРПДРФ анализ всех изученных изолятов VV и IV выполнен автором самостоятельно. Секвенирование ПЦРфрагмснтов проводилось А. Г. Блиновым ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, И. В. Бабкиным и Качко ФГУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора, г. Новосибирск. Филогенетический анализ генетического разнообразия изолятов вирусов проведен автором совместно с И. В. Бабкиным. Вирусные заболевании культивируемых видов рыб Следствием бурного развития аквакультуры морских и речных рыб стало частое возникновение эпизоотий, подрывающих производство рыбы. Зачастую причиной эпизоотий являются вирусные заболевания, многие из которых вызываются рабдовирусами. Рабдовирусы рыб относятся к двум родам этого семейства везикуловирусам и новирабдовирусам. Семейство vii Главным критерием классификации рабдовирусов служит морфология рабдо означает палочковидный. Все рабдовирусы вытянуты в длину и имеют форму нули или бациллы Пайк, . В настоящее время известноболсс 0 рабдовирусов, которые инфицируют человека, других млекопитающих, рыб, насекомых некоторые из них реплицируются в членистоногих и ранее были отнесены к семейству Арбовирусов и растения. Семейство подразделяется на шесть родов Vivi, vi, vi vi, vivi, vi. Все рабдовирусы имеют близкие размеры это частицы 0x нм. Около белка связано с РНК. РНКполимеразы С . Другие два белка связаны с оболочкой вируса. Тем самым Мбелок поддерживает характерную для всех представителей семейства vii пулеобразную форму вирусной частицы .