Гибридные лектины с измененными углеводсвязывающими свойствами и их влияние на бобово-ризобиальный симбиоз

• Автор: Губайдуллин, Ирек Ильясович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 149 с.

Оглавление

Список сокращений и условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Происхождение бобоворизобиального симбиоза

1.2. Специфичность и механизм становления бобоворизобиального симбиоза.

1.3. Сигналлинг между ризобиями и бобовым растением

1.4. Лектины бобовых растений

1.4.1. Роль лектина в бобоворизобиальном симбиозе

1.4.2. Структура и специфичность лектинов

1.5. Особенности организации генома клубеньковых

бактерий
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований
2.2. Выделение и очистка ДНК растений
2.3. Выделение и очистка ДНК ризобий.
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК
2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.7. Аналитический гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
2.8. Препаративный гельэлектрофорез ДИК в неденатурирующих условиях
2.9. Элюция ДНК из агарозных гелей.
2 Клонирование фрагментов генов лектина бобовых
растений
2 Полимеразная цепная реакция
2 Подготовка компетентных клеток.
2 Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной
2 Ссквснированис ДНК ферментативным методом
2 Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях секвенирующий гель
электрофорез.
2 Компьютерный анализ нуклеотидных
последовательностей.
2 Бактериальные штаммы и фагмидные вектора.
2 Экспрессия белка и его выделение.
2. Электрофоретическое фракционирование белков в
денатурирующих условиях.
2 Реакции гемагглютинации
2 Реактивы и материалы.
2 Составы использованных стандартных растворов
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
,, 3.1. Анализ углсводсвязывающих участков лектинов бобовых
растений
3.1.1. Клонирование и секвенирование фрагментов гена
лектина бобовых растений.
3.1.2. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей ссквенированных фрагментов генов
лектина козлятника восточного и лекарственного
3.1.3. Сравнительный анализ углсводсвязывающих аминокислотных последовательностей лектинов бобовых
растений.
3.1.4. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвснированных фрагментов генов лектина клевера белого, лугового и волосистоголового
3.2. Создание гибридных белков лектина и анализ их углеводсвязывающих свойств
3.2.1. Создание гибридных конструкций гена лектина
3.2.2. Синтез лсктинов в клетках .i и их выделение
3.2.3. Анализ специфичности лектинов
3.3. Анализ влияния природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями.
3.3.1 Экзогенная обработка лектинами бактерий в ризосфере бобовых растений.
3.3.2 Влияние лектинов , и на симбиоз i и i i с ризобиями
3.3.3 Влияние лектинов , на симбиоз i
iv с ризобиями.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Обнаружено, что лектины бобовых растений одной группы перекрестной инокуляции имеют формируемую их углеводсвязывающими последовательностями УСП сходную специфичность к простым сахаридам. Показано, что в УСП лсктинов присутствуют консервативные аминокислоты, определяющие специфичность связывания лектина с ризобиальными рецепторами, что указывает на участие углеводсвязывающего участка лектина и в формировании специфичности к сложным сахаридам, из чего следует, что специфичность к моносахаридам является необходимым, но не достаточным условием, чтобы лектины специфично связывались с поверхностными полисахаридами ризобий. Впервые показано, что лектин является одним из критических факторов, обусловливающих существование двух групп инокуляции . . v. . ii . Сходство в строении факторов биоваров . Впервые секвенированы фрагменты генов лектина ii , . . i. Обнаружено, что эти растения из одной группы перекрестной инокуляции имеют, тем не менее, совершенно разные углеводсвязывающие последовательности лектинов. i, тогда как сравнительный анализ УСП на нуклеотидном уровне и древо, основанное на последовательностях внутренних транскрибируемых сисйсеров генов рРНК, свидетельствуют о том, что луговой клевер входит в группу ii . Впервые созданы уникальные гибридные конструкции, представляющие собой полноразмерный ген лектина гороха с замещенными углеводсвязывающими участками из генов . i i, М. . Синтезируемые в клетках . и связывали сахариды и вызывали агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и ассоциации субъединиц. Замещение УСП лектина гороха на УСП лектинов М и . Впервые показано, что лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, вызывающие специфические реакции симбиоза. При обработке гибридным лектином бактерий из клубеньков i идентифицированных нами по генам рРНК как микроорганизмы, близкие к i i в ризосфере люцерны впервые наблюдали нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков. Это свидетельствует о том, что лектин является одним из критических факторов в данной симбиотической системе. Практическая значимость. Знания о закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами. Гибридные лектины можно использовать для исследований физиологических свойств этого белка в бобоворизобиальных взаимодействиях, более того, они способны расширять специфичность растений к ризобиям, то есть увеличивать круг микросимбионтов, из которых растения могут выбрать наилучшего партнера для азотфиксации, что может привести к росту урожайности сельскохозяйственных культур. Апробации работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых Молодые ученые ВолгоУральского региона на рубеже веков Уфа, г. Биология наука го века Пущино, г. III съезде Биохимического общества СанктПетербург, г. XVI зимней молодежной научной школе Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии Москва, г. Наука и бизнес Поиск и использование новых биомолекул биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина. Пущино, . Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны фантами РФФИ 4, РФФИАгидель 3, фантом Профаммы поддержки ведущих научных школ РФ НШ4. Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных СМВБ, вспВапк и ООВ5. Диссертация изложена на 8 страницах, содержит 3 таблицы и рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования и их обсуждения глава 3, заключения, выводов и списка литературы, включающего 9 источника отечественных и 4 зарубежных.