Исследование свойств ДНК-полимераз из эмбрионов морского вида ежа Sirongylocentrotus Intermedius

• Автор: Терентьев, Леонид Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 144 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Классификация эукариотических ДНКполимераз

ДНКПОЛИМЕРАЗА О

Молекулярный вес ДНКполимеразы а

Ферментативные свойства ДНКполимеразы о Использование различных матриц ДНКполимеразой X

Последовательность взаимодействия ДНКполимеразы с с субстратами

Процессивность ДНКполимеразы

Внутриклеточная локализация ДНКполимеразы О

ДНКПОЛИМЕРАЗА р

ДНКПОЛИМЕРАЗА
ДНКПОЛИМЕРАЗА 8
РОЛЬ ДНКПОЛИМЕРАЗ В РЕПЛИКАЦИИ ДНК
РОЛЬ ДНКПОЛИМЕРАЗ В РЕПАРАЦИИ ДНК
БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ
ДНКПОЛИМЕРАЗЫ МОРСКОГО ЕЖА АО
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ А А
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ АА
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава I. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРА ДНКПОЛИМЕРАЗ В
СУММАРНОМ БЕЛКОВОМ ПРЕПАРАТЕ
Глава II.ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДНКПОЛИМЕРАЗ
ИЗ ЭМБРИОНОВ МОРСКОГО ЕЖА бА
Выделение ДНКполимеразы ос 6А
Выделение ДНКполимеразы
Характеристика физикохимических свойств ДНКполимераз
Глава III.МАТРИЧНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНКПОЛИМЕРАЗ Глава У. ПРОПЕССИВНОСТЬ ДНКПОЛИМЕРАЗ ИЗ ЭМБРИОНОВ
МОРСКОГО ЕЖА
Глава У. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЗАПОЛНЕНИЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ПРОБЕЛА В ДНК МАТРИЦЕ ДНКПОЛИМЕРАЗАМИ МОРСКОГО ЕЖА
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ НО
КРАТКИЕ ВНВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Фермент широко распространн в природе и обнаружен в клетках млекопитающих, птицах, амфибиях, иглокожих, одноклеточных и низших эукариотах , а также в растениях . Фермент высокой степени очистки сохраняет свою активность в течение 12 месяцев при 0С в присутствии 0меркаптоэтанола дитиотреитола, фосфата калия, глицерина или сахарозы . Добавление ДНК к очищенной ДНКполимеразе стабилизирует е активность при более высокой температуре ,. Все исследованные ДНКполимеразы ос имеют изоэлектрическую точку в области 5,25,6 . Гомогенная ДНКполимераза, как правило, не содержит ни эндо, ни экзонуклеазных активностей 5, но способна осуществлять пирофосфоролиз и обмен пирофосфата ,. Способность ДНКполимеразы оС агрегировать с различного рода белками, а также образовывать димерные и тетрамерные ассоциаты оказала существенное влияние на определение молекулярного веса фермента. При этом, в случае недостаточно очищенного препарата, обнаруживался широкий спектр ДНКполимераз с различным молекулярным весом 5,. Данные, полученные на гомогенных препаратах, существенно сузили интервал значений молекулярного веса фермента. Так, из тимуса телнка выделен гомогенный препарат ДНКполимеразы с с константой седиментации 9 Б и мг . По данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия фермент состоит из четырх полипептидных цепей с мг , 0, 0 и 0. ДНКполимеразы с. Присутствие протеолитической активности, которая уменьшала константу седиментации ДНКполимеразы с 7,3 в до 5,4 Б , обнаружили в ядерной фракции печени крыс , причм в результате протеолиза повышалась удельная активность ДНКполимеразы, ДНКполимеразас9 выделенная из дрозофилы , представляет собой белок с молекулярным весом , состоящий из четырх субъединиц с Мг ос , 0 у С У и 0 Только субъединица обладала ДНКполимеразной активностью. Применяя антитела к интактной ДНКполимеразе оС и е отдельным субъединицам, авторы обнаружили, что ос субъединица,являющаяся основной полимериь. Аналогичная субъединичная структура ДНКполимеразы ОС из дрозофилы отмечена в работе Л Мехали и др. ДНКполикеразу оС , состоящую из пяти субъединиц с мг , 0, 0, 0 и 0. Полипептид с мг обладал полимеразной активностью и был гомогенным по данным электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Как и в случае с ДНКполимеразой оС из клеток дрозофилы , полимеразная активность в присутствии всех субъединиц значительно возрастала. Фишер и Корн представили данные о выделении из клеток КВ гомогенной ДНКполимеразы с молекулярным весом димерная форма , состоящей из двух полипептидов с мг 0 и 0, присутствующих в эквимолярных количествах. I0I0, обладающей ДНКполимеразной активностью, и дополнительными белковыми факторами, в некоторых случаях оказывающими влияние на полимеразную активность. Не исключено, что расхождения в значениях молекулярного веса ДНКполимеразы оС вызваны различной степенью нативности фермента, получаемого в процессе очистки. Возможно также существование межвидового различия у этих ферментов. ДНКполимераза оС для проявления своей активности при использовании в качестве матрицызатравки природной ДНК нуждается в присутствии четырх дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Исключение из состава инкубационной смеси одного из снижает активность фермента. В реакции полимеризации сШТР не могут быть заменены на или , не эффективны также 5,. Активность ДНКполимеразы оС абсолютно зависит от ионов двухвалентных металлов 2 или Мп2 . Оптимальная концентрация ионов 2 в реакционной смеси составляет 4 мМ, Мп2 0,58 мМ . Уровень активности фермента в присутствии 2 в 57 раз выше, чем с Мп2 в реакции полимеризации с активированной ДНК . Оптимум ДНКполимеразы составляет 7,58,5. На активность фермента влияет присутствие в инкубационной смеси солей I или , которые в концентрации до мМ проявляют стимулирующее действие, а при более высоких ингибируют реакцию 5,,. Однако этот эффект присущ не всем ДНКполимеразам оС . Гросс и Краусс сообщили, что ДНКполимераза оС, выделенная ими из тимуса телнка, стимулируется I в концентрации до 0 мМ.