Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств

• Автор: Усачев, Евгений Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация возбудителя.

1.2. Молекулярнобиологическая характеристика вируса болезни

Ныокасла.

1.2.1. Структура вириона

1.2.2. Геном вируса и кодируемые им белки.

1.2.2.1. КР нуклеокапсидный белок.

1.2.2. 2. Белки, кодируемые геном Р

1.2.2.2.а. Фосфопротеин Р

1.2.2.2.Ь. Белки V и
1.2.2.3. Белок М.
1.2.2.4. Белок Г.
1.2.2.5. Белок НИ
1.2.2.6. Белок Ь
1.2.3. Протеолитическая активация белка слияния.
1.2.4. Адсорбция и проникновение вируса в клетку
1.2.5. Репликация генома вируса БН
1.2.6. Транскрипция мРНК вируса БН
1.2.7. Сборка вирионов вируса БН
1.3. Молекулярногенетические основы патогенности вируса болезни
Ныокасла,
1.4. Детекция и типирование штаммов ВБН
Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Анализируемые штаммы из базы данных вепБапк.
2.2. Исследуемые штаммы
2.3. Места сбора и объем полевых материалов в Приморском крае в
2.4. Олигонуклеотиды использованные в экспериментах
2.5. Выделение РНК.
2.6. Реакция обратной транскрипции ОТ
2.7. Проведение полимеразной цепной реакции
2.8. Определение 5концевой последовательности геномной РНК
2.9. Электрофорез ДНК.
2 Приготовления ДНК для секвсиирования.
2 Секвенирование ДНК.
2 Построение алайментов и филогенетический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И Р1Х ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Создание лабораторного варианта ОТПЦР тестсистемы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах.
3.2. Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств.
3.2.1. Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии.
3.2.2. Анализ штаммов ВБН, изолированных от сельскохозяйственных птиц в Казахстане в гг.
3.3. Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких птиц и домашних в Приморском крае в г
3.4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых штаммов ВБН и ПЦРположительных образцов в пределах генетических групп
3.5. Анализ сайта расщепления белка Б исследуемых штаммов и ПЦРположительных образцов .
3.6. Анализ полного генома штамма ВБН Б1етаАгакап.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
Благодарности
Список литературы


Провести определение первичной структуры гена Р или его участка культуральных штаммов вируса БН всего , выделенных на территории России , Украины 3, Белоруссии 1 и Казахстана от диких и домашних птиц в период с по г. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных ОепВапк. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала 2, собранного от диких птиц на территории Приморского края в г. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных ОепВапк, с помощью филогенетического анализа. Определить первичную структуру полную генома российского штамма 8егпаАБга1сап вируса БН субтииа 5Ь. Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотип ирования по фрагменту гена Б 4 н. Научная новизна и практическая значимость. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТПЦР тестсистемы для детекции вируса БН. Установлено, что на территориях Астраханской области г. Приморского края России гг. БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с по гг. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнеснные к субтипам За, 5Ь и 5с1, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БЫ генотипов 1 и 2 лентогениому характеру патогенности. Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5Ь, и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств. Генетически охарактеризован, на основе определнной нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм етаАз1гак1шп вируса БЫ, принадлежащий субтипу 5Ь. Проведнный анализ соответствия результатов генотиггирования по фрагменту гена Б 4 н. Р по классификации АМоиБ с соавт. К0,. Таким образом, показано правомерное использование участка гена Б 4 н. ВБН в пределах рода Ауи1аугиз и внутри основных генетических линий. Основные положения, выносимые на защиту. Создан лабораторный вариант детекционной ОТПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БЫ, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. БЫ четырх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Б 4 н. ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 51. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БЫ, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма егпаАгакЬап вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с вслогенным патотипом. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена Б и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции К0,. Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена Б 4 н. ВБН в пределах рода Лги 1аУ1 Я и внутри основных генетических линий.