Свойства, структура и функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3

• Автор: Кононенко, Артём Вадимович
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 стр.

ВВЕДНИЕ 7 стр.

1. Глава 1. ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ы.Терминация трансляция опосредована белковыми факторами 1го и 2го классов. стр.

1.2.Особенности структуры факторов терминации 2го класса. стр.

1.2.1. Структурные особенности домена ГТФаз. стр.

1.2.2. Первичная и третичная структуры 3 и 3 стр.

1.3.ГТФазный цикл в рибосоме. стр.

1.4.Функциональные свойства

1.4 Л. Роль 3 в терминации трансляции у эукариот стр.

1.4.2. Нетерминационные функции 3 стр.
1.4.3. Взаимодействие 3 и стр.
1.5.3 не является функциональным аналогом 3 стр.
1.6.Струкгурнофункциональные свойства . стр.
2. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1.Штаммы бактерий, плазмиды, среды и реактивы стр.
2.2.Методы исследований
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из . i стр.
2.2.2. Трансформация . i плазмидной ДНК стр.
2.2.3. Синтез и выделение белков
2.2.3.1. Получение 1 человека для исследования методом малоуглового рассеяния. стр.
2.2.3.2. Получение еЯТ 1 и мутантов еИЛ человека для исследования калориметрическими методами. стр.
2.2.3.3. Получение еШРЗ человека. стр.
2.2.3.4. Получение доменов еЯР1 человека.
2.2.3.4.1. Получение И,Ми ИМ доменов. стр.
2.2.3.4.2.Получение С и МС доменов. стр.
2.2.4. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ. стр.
2.2.5. Измерение флуоресценции растворов белков. стр.
2.2.6. Измерения малоуглового рассеяния. стр.
2.2.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия ДСК. стр.
2.2.8. Круговой дихроизм КД. стр.
2.2.9. Изотермическая титрационная калориметрия стр.
3. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1.Связь между термостабильностью еЯР1 и изменениями функциональной активности его мутантов стр.
3.1.1. Тепловая денатурация еШЧ человека и его мутантов. стр.
3.1.2. Термостабильность мутантов еЯР1 и его ЯРактивность. стр.
3.2.Молекулярная морфология еШЧ в растворе стр.
3.3.Образование четверного комплекса еЯР1еЯРЗГТФМ2 в растворе. стр
3.3.1. Взаимодействие еЯРЗ с гуаниловыми нуклеотидами. стр.
3.3.2. Термодинамические параметры образование комплекса между еЯР 1 и еЯРЗ стр.
3.3.3. Связывание ГТФ комплексом еЯРПеЯРЗ стр.
3.3.4. Обмен нуклеотидов в комплексе еЯР1еЯРЗГДФГТФ стр.
3.3.5. еЯТ 1 как эффектор связывания гуаниловых нуклеотидов. стр.
3.3.6. Схема взаимодействия между еЯБЗ и его лигандами стр.
3.3.7. Роль еКР1 по отношению к еЛРЗ стр.
3.3.8. Роль магния в связывании гуаниловых нуклеотидов стр.
3.3.9. Сравнение полученных результатов с данными литературы. стр.
3.4.Роль индивидуальных доменов еИР1 в связывании ГТФ с еЯРЗ.
Взаимодействия между доменами еР1. стр.
3.4.1. Связывание еКРЗ с индивидуальными доменами еШЧ. стр.
3.4.2. Взаимодействия между индивидуальными доменами е1ИЧ стр.
3.4.3. Связывание ГТФ с еГГЗ в присутствии М и С доменов еШТ стр.
3.4.4. Роль доменов сШ в формировании ГТФсвязывающего центра еШТ стр.
3.5.3аключение. стр.
ВЫВОДЫ 4 стр.
БЛАГОДАРНОСТИ 5 стр.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Немногочисленные и противоречивые данные о взаимодействии i vi между , М и С доменами , между и 3, между 3 и гуаниловыми нуклеотидами недостаточны для понимания механизма ГТФазного цикла 3 в терминации трансляции. Применение различных физических методов позволяет существенно прояснить многие из перечисленных вопросов. Цель работы состояла в использовании физических методов для 1 оценок стабильности белка человека после внесения в молекулу точечных мутаций, 2 установление сходства и различий в конформации в кристалле и в растворе, 3 изучения взаимодействия между , М и С доменами , между и 3, между 3 и гуаниловыми нуклеотидами. В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования экспрессировать гены полноразмерного и 3 лишнного с конца 8 аминокислот человека, мутантов , а также , М, С, М и МС доменов в клетках Е. ДСК оценить изменения стабильности белковой глобулы в растворе в результате мутаций. ТС взаимодействия между Ы, М и С доменами еЯР1, между еШЧ и еЯБЗ, между еКРЗ и гуаниловыми нуклеотидами. Установлено, что плавление молекулы еКР1 человека, состоящей из трх доменов, носит кооперативный характер, это свидетельствует о взаимодействии между доменами внутри молекулы в растворе. Ряд замен в домене не изменяет термостабильность белка, а в некоторых случаях даже приводит к ее некоторому увеличению. У этих мутантов избирательность утраты функции стимуляции гидролиза пептидилтРНК в Ручастке рибосомы в присутствии стопкодонов не связана с дестабилизацией их трхмерной структуры, а обусловлена, скорее всего, локальными изменением стереохимии боковых групп этих аминокислотных остатков в функциональноважных участках Ыдомена. Обнаружены аминокислотные остатки в Ыдомене, существенные для поддержания стабильности структуры еКР1 и влияющие на избирательное узнавание стопкодонов мРНК в рибосоме. Определены интегральные структурные параметры и форма молекул сЮЛ человека по данным МУР в растворе, конформация еШЛ в растворе близка к конформации в кристалле. С помощью изотермической калориметрии определены термодинамические параметры и предложена возможная схема взаимодействия между еКРЗ, еКР1 и гуаниловыми нуклеотидами. Обнаружены взаимодействия . ШЧ в растворе. Показано, что Мдомен е Р1 также взаимодействует с еКРЗ, определены домены еМЧ необходимые для связывания ГТФ с еЯРЗ. Глава 1. Терминация трансляции происходит на рибосомах в тот момент, когда в участке рибосомы находится один из трех терминирующих кодонов , или , а в участке располагается пептидилтРНК. Существование терминирующих стоп, нонсенс кодонов вытекает из природы генетического кода. Нонсенсмутации мутации стоп кодонов обнаружены впервые экспериментально в фаговобактериальной системе. Затем все три стоп кодона были идентифицированы , и . Присутствие этих триплетов в мРНК служит i vi сигналом для освобождения полипептидной цепи из рибосомы. Стоп кодоны не узнаются обычными тРНК, читающими значащие кодоны, но могут читаться особыми супрессорными тРНК. Вскоре, после идентификации стоп кодонов нонсенссупрессия была показана i vi и i viv посредством мутаций в генах бактериальных тРНК. Стоп кодоны мРНК у прокариот узнаются двумя специфическими белками названными 1 узнат и , 2 и . Установлены нуклеотидные последовательности генов, и соответственно, первичные структуры белков, 1 и 2 . . i . Несмотря на то, что существование белков, обладающих способностью стимулировать гидролиз пептидилтРНК в эукариотах, показано ещ в х годах прошлого века в ретикулоцитах кролика, существование эукариотического белка со свойствами фактора терминации 1го класса, названного , обнаружено сравнительно недавно v . узнат все три стоп кодона. Подобно бактериальным 1 и 2, катализирует гидролиз пептидилтРНК, находящейся в рибосоме, в присутствии одного из трх стоп кодонов v .