Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus

• Автор: Ковалевская, Жанна Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов

1.1.1 .Общие сведения о бактериальных токсинах

1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов

1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности IО

1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов

1.2. Типы бактериальных гемолизинов

1.2.1. Фосфолипазы цитолизины с ферментативной активностью

1.2.2. Порообразующие гемолизины
1.3. Механизмы действия бактериальных гемолизинов
1.4. Механизмы секреции бактериальных токсинов
1.5. В. как объект для изучения гемолизинов
1.6. Спектр гемолизинов, продуцируемых i
1.6.1. Сфингомиелиназа и цсрсолизин АВ
1.6.2. Цереолизин гемолизин I
1.6.3. Гемолизин ВТ
1.6.4. Гемолизин III
1.6.5. Гемолизин IV токсин
1.6.6. Цсрсолизинподобный гемолизин
1.6.7. Гемолизин II
Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИЛ. Магсриаты
П. 1.1. Штаммы бактерий, плазмидные векторы
II. 1.2. Среды и основные буферы
И. 1.3. Материалы и реактивы
И.2. Методы исследования
.2.1. Выделение илазмидной ДНК
.2.2. Препаративное выделение фрагмента ДНК
.2.3. Проведение реакций рестрикции и лигирования ДНК
.2.4. ПЦРамплификация ДНК
.2.5. Получение компетентных клеток
.2.6. Трансформация
.2.7. Анализ рекомбинантных клонов
.2.8. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу
.2.9. Плазмидиые конструкции
.2 Анализ первичной последовательности ДНК
.2 Тестирование гемолитической активности
.2 Получение бесклеточных экстрактов
П.2 Электрофорез в полиакриламидном геле
.2 Определение количества белка
.2 Приготовление сорбентов
.2 Экспрессия и очистка до гомогенного состояния внеклеточного гемолизина II
.2 Очистка внутриклеточного гемолизина II
П.2 Экспрессия и очистка рекомбинантного белка I IIIi6
П.2 Перенос белков с геля на мембрану вестерн трансблоттииг
Н.2 Исследование на бислойных липидных мембранах
II.2 Электронная микроскопия олигомеров связанных с линосомами
И.2 Определение диаметра пор с помощью осмопрогектантов
Н.2 Моделирование структуры поры гемолизина II
Н.2 Влияние на разные типы клеток
П.2 Влияние на макроорганизмы
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I И. 1 .Экспрессия гемолизина в клетках . i
1.2. Очистка внеклеточного гемолизина II
1.3. Очистка внутриклеточного гемолизина II
Ш.4. Продукция зрелого при помощи секрециоиного аппарата . i
1.5. Клонирование генетической детерминанты гемолизина И
III.5.1. Получение рекомбинантных клонов и их фенотипический анализ
III.5.2. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
1.6. Цитолитичсское действие очищенного гемолизина II
1.7. Моделирование структуры поры гемолизина И
1.8. Размеры пор сформированных гемолизином II
II 1.9. Свойства каналов сформированных гемолизином II
1 Влияние температуры на формирование пор гемолизином
III. .1. Первый шаг, взаимодействие с мембранами, не зависит от темперагуры
III. .2. Структура пор, сформированных при 4С и С, различается
1 Патогенное действие гемолизином II на макроорганизмы
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


При этом одним из важнейших факторов вирулентности как в ходе развития листериозиса, так и при инфекциях простейших является гемолитический токсин, секретируемый листериями, листериолнзин , i . Попадая в многоклеточный организм . По завершении процесса пролиферации благодаря действию гемолизина листсриолизина происходит разрушение мембран макрофагов и выброс большого числа бактерий в организм. При размножении листерий внутри простейших имеет место аналогичный процесс, также обусловленный активностью листсриолизина. Таким образом, возможно, что вырабатывающие цитолизины патогенные микроорганизмы, живущие в окружающей среде и размножающиеся внутриклеточно, стали вирулентны для человека, используя свою способность к выживанию и размножению внутри клеток простейших. Итак, свойство бактерии продуцировать цитолитическис токсины сыграло, очевидно, важную адаптивную роль в процессе перехода сс на патогенный путь развития и занятия ею новой экологической ниши. А для чего нужны цитолизины и, в частности, гемолизины микроорганизму, уже ставшему патогенным Одна из этих функций, полезных для бактерии на данном этапе, рассматривалась выше на примере . . Существует и теория, согласно которой, помимо подобных, достаточно специфических функций, гемолизины патогенных бактерий имеют другое, более универсальное предназначение. Предполагается, что эти токсины служат бактерии, обитающей в организме теплокровного животного, для освобождения из эритроцитов при их лизисе гемоглобина, который используется микробной клеткой как источник ионов железа . Для подтверждения этой гипотезы исследовалась гсмоглобинсвязывающая активность клеток i , секрстирующих гемолизин, и было показано, что В. Также была обнаружена корреляция между способностью данной бактерии использовать эритроциты как источник железа в среде и свойством продуцировать гемолизины . Подобная ситуация описана и для Vii , . , , . Предполагается, что гемолизины с ферментативной активностью фосфолипазы необходимы бактериям для метаболизма фосфолипидов. Косвенным подтверждением данного заключения служит тот факт, что во многих случаях синтез этих ферментов регулируется фосфатом i, . Таким образом, имеется ряд фактов, свидетельствующих о важной роли цитолизинов для микроорганизмов, их продуцирующих. Белки, обладающие гемолитической цитолитической активностью, продуцируются широким спектром как патогенных, так и непатогенных грамлоложительных и грамотрицатсльных бактерий. Представители многих видов микроорганизмов вырабатывают не один, а несколько различных гемолизинов. При всем своем многообразии гемолитические токсины могут быть разделены на две большие группы, образованные с учетом принципиальной разницы в механизме их повреждающего воздействия на мембраны эукариотических клеток. Это 1 цитолизины, вызывающие ферментативный гидролиз компонентов мембран, и 2 цитолизины, которые встраиваются в мембрану и образуют в ней поры, изменяющие проницаемость мембраны, что приводит в итоге к осмотическому лизису клетки. Класс энзиматических гемолизинов представлен довольно многочисленной группой фосфолипаз. Основными структурными компонентами бислойных цитоплазматических мембран клеток млекопитающих являются фосфолипиды и холестерин. Многие бактерии продуцируют различные фосфолипазы, которые гидролизуют глицерофосфолипиды и сфинголипиды, представляющие основные классы фосфолипидов клеточных мембран , . Но типу воздействия на субстрат фосфолипазы распадаются на две обширные категории ацилгидролазы фосфолипазы А1 и А2 и фосфодиэстеразы С и i, . Микроорганизмы наиболее часто вырабатывают фосфолипазы С, которые гидролизуют эфирную связь между диглицеридом и замещенной фосфорной кислотой. Фосфолипазы типов А и у бактерий встречаются гораздо реже. Способность вырабатывать фосфолипазы С присуща микроорганизмам из родов ii, i, , i, , ii, Vii .