Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом

• Автор: Грищук, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биосинтез стероидных гормонов

1.1.1. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человекаобщие стадии

1.1.2. Синтез минералокортикоидов.

1.1.3. Синтез глюкокортикоидов

1.1.4. Синтез половых гормонов

1.2. Наследственные нарушения биосинтеза стероидов

1.2.1. Адреногенитальный синдром

1.2.2. Формы недостаточности гидроксилазы
1.2.3. Частота недостаточности гидроксилазы
1.3. Особенности структуры и расположения гена 2.
1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса.
1.3.2. Структура Xмодуля
1.3.3 Структура гена 2 и псевдогена 1.
1.4. Молекулярногенетические механизмы возникновения и методы выявления мутаций в гене 2I2
1.4.1. Крупные делеции гена по механизму неравного кроссинговера.
1.4.2. Небольшие генные конверсии.
1.4.3 Мутации, не связанные с псевдогеном.
1.4.4. Возникновение мутаций vЗО
1.4.5. Методы выявления мутаций в гене 2.
1.4.6. Молекулярногенетический анализ гена 2 в российской популяции.
1.4.7. Корреляция между генотипом и клинической формой заболевания при дефиците гидроксилазы
1.5. Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид гидроксилазы человека
1.6. Стероид гидроксилаза как представитель надсемейства цитохромов Р0
1.6.1. Состав и функциональное значение надсемейства цитохромов Р0
1.6.2. Механизм монооксигеназной реакции.
1.6.3. Пространственная организация молекул надсемейства
цитохромов Р0
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1 Пациенты и молекулярногенетический анализ мутаций.
2.2. Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы
2.3. Создание генноинженерных конструкций и сайтспецифичный мутагенез
2.4. Культивирование и трансфекция клеток 7
2.5. Анализ каталитической активности в клетках 7
2.6. Получение рекомбинантных бакуловирусных векторов.
2.7. Получение рекомбинантных бакмид.
2.8. Трансфекция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов
2.9. Определение вирусного титра
2 Экспрессия в клетках насекомых 9 и Я5.
2 Получение микросомных фракций
2 Анализ каталитической активности в микросомной фракции Я5
2 Измерение концентрации белка.
2 ДСНПААГ электрофорез
2 Вестернблотанализ
2 Иммунофлуоресценция
2 Получение компетентных клеток .i и трансформация.
2 Анализ клонов методом ПЦР
2 Выделение плазмидной ДНК.
2 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2 Фракционирование и очистка фрагментов ДНК в агарозном геле.
2 Лигирование
2 Моделирование трехмерной структуры.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Введение мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК гена 2.
3.2. Экспрессия и функциональный анализ 2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках 7
3.3. Влияние мутаций на локализацию 2 в клетках 7
3.4. Экспрессия кДНК 2I2 и мутантного варианта 9 в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы
3.5. Ферментативная активность 2 и 29
в препаратах микросом из клеток Я5
3.6. Анализ модели трехмерной структуры
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Отмеченная корреляция генотипа и фенотипа позволяет классифицировать мутации в зависимости от степени инактивации гидроксилазы, что крайне важно для прогнозирования тяжести заболевания в ходе пренатальной диагностики и своевременной пренатальной или ранней постнатальной терапии. Вовремя начатая пренатальная терапия помогает предупредить осложнения, связанные с нарушением стероидогенеза i , такие как повреждения репродуктивной функции, низкорослость, трансформация пола, а также водноэлектролитный дисбаланс в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы заболевания. При классификации редких и уникальных мутаций, когда статистический анализ клинических проявлений невозможен, наиболее надежным подходом является функциональная характеристика мутаций i vi с последующим анализом модели пространственной структуры А2 и установление соответствия между эффектами, обнаруженными i vi, и фенотипом пациента. Для проведения функционального анализа мутаций 2 i vi наиболее часто используемой системой экспрессии является система на основе клеток млекопитающих линии 1 и 7. Имеются также данные по экспрессии гена 2 в дрожжах, а также в клетках млекопитающих с использованием вируса осповакцины. Однако одним из наиболее перспективных подходов к получению высокого уровня экспрессии в среднем 3 от общего количества белка клетки функциональноактивных белков эукариот, в большинстве случаев прошедших все стадии посттрансляционной модификации и созревания, для проведения функционального анализа и кристаллографии является бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Несколько цитохромов Р0 были успешно синтезированы в клетках насекомых, однако данных по экспрессии гена гидроксилазы до настоящего времени не было. Цель и задачи исследования. Целью работы является функциональная характеристика уникальных миссенсмутаций 9, 8, 2, 6, выявленных при проведении молекулярногенетического тестирования российских пациентов в рамках совместного проекта Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Эндокринологического научного центра РАМН. Биосинтез стероидных гормонов. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человека общие стадии. Стероидные гормоны всех классов прогестагены, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, андрогены и эстрогены синтезирутся из холестерина. Синтез прогестагенов, минерало и глюкокортикоидов и андрогенов происходит в корковом веществе надпочечников. Помимо коры надпочечников, прогестагены синтезируются в желтом теле, андрогены в семенниках. Синтез эстрогенов происходит в яичниках. Надпочечники парные железы внутренней секреции, расположенные на верхних полюсах почек. Надпочечники играют важную роль в регуляции обмена веществ и в адаптации организма к неблагоприятным условиям состоят из мозгового вещества, в хромаффинной ткани которого синтезируются катехоламины, и коры, вырабатывающей стероидные гормоны рис 1. Снаружи надпочечники заключены в соединительнотканную оболочку. Корковое вещество составляет примерно 23 массы надпочечника и делится на клубочковую, пучковую и сетчатую зоны рис. Клубочковая зона , прилегающая тонким слоем к соединительнотканной капсуле, состоит из клеток неправильной формы. В клубочковой зоне синтезируется альдостерон основной минералокортикоид, участвующий в регуляции водносолевого обмена. Рис. Строение надпочечника человека. В сетчатой, внутренней, зоне ii группы клеток имеют вид неправильной сетки. Здесь вырабатываются половые гормоны андрогены. Важную роль в биосинтезе стероидных гормонов играют реакции гидроксилирования, осуществляемые ферментами надсемейства цитохромов Р0 п. Так, из девяти стероидогенных ферментов человека рис. Р0, из них пять ферментов, за исключением ароматазы, экспрессируются в коре надпочечников. Стероид гидроксилаза гидроксилаза, А2 принимает участие в синтезе и глюко, и минералокортикоидов, и является одним из основных ферментов стероидогенеза. Стероидные гормонов всех классов образуются из холестерина. Молекула холестерина содержит углеродных атомов, тогда как в состав стероидных гормонов входит не более атома углерода.