Специфичность встраиваний P элемента в локус генов бтш70 D. melanogaster и влияние инсерций на функционирование этих генов

• Автор: Шилова, Виктория Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Белки и гены теплового шока общая характеристика

1.1.1. Гены теплового шока

1.1.2. Основные семейства БТШ

1.1.3. Механизмы регуляции ответа на тепловой шок

1.2. Структура кластера генов 6i у i

1.3. Мобильные элементы как возможный фактор эволюции генов ТШ

1.4. Особенности Р элемента и его использование в инсерционном мутагенезе

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Линии i 3
2.2. Модель генетического анализа
2.3. Выделение геномной ДНК из мух
2.4. Гибридизация геномной ДНК по Саузерну
2.5. ГЩРанализ
2.6. Выделение фрагментов ДИК
2.7. Секвенирование ДНК
2.8. Количественный ГЦРанализ в реальном времени
2.9 Выделение мРНК из мух и ее анализ методами электрофореза и Нозеригибридизации
2 Лигирование фрагментов ДНК
2 Трансформация компетентных клеток .i
2 Выделение плазмидной ДНК
2 Одномерный электрофорез белков
2 Вестернблоттинг
2 Двумерный электрофорез белков
2 Включение метионина3 в белки слюнных желез i
2 Определение термоустойчивости мух
2 Определение фертильности трансгенных мух
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание транскрипционых факторов
2 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика системы скрещиваний для получения ииссрций конструкции на основе Р элемента в гены бтгиЮ методом инсерционного мутагенеза
3.2. Идентификация инсерций 2 методом Саузернблот анализа
3.3 Точная локализация полученных инсерций 2
3.4. Влияние инсерций 2 на уровень транскрипции бтиПО
3.5. Анализ синтеза БТШ в трансгенных линиях
3.6. Анализ инсерций 2, сопровождающихся перестройками геномной ДНК
3.7. Базальная и индуцированная термоустойчивость трансгенных линий
3.8. Определение плодовитости потомства трансгенных линий
3.9. Вклад нмБТШ в термоустойчивость
4. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Соответственно, в большинстве случаев изменения, затрагивающие гены бтшЮ, элиминируются естественным отбором, а их высокая консервативность поддерживается механизмом внутри и межлокусной конверсии Ii . Одним из вопросов, привлекающих исследователей, является рассмотрение закономерностей эволюции этого семейства. В литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что эволюция системы генов 6i могла идти как путем увеличения числа генов Гарбуз Д. Г., , так и путем инактивации некоторых их копий вследствие внедрения мобильных элементов МЭ . i . Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции. Имеются данные, что гены бтгиЮ, в особенности их регуляторные зоны, являются горячими точками при транспозиции МЭ изза конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК. В данной работе была предпринята попытка ответить на вопрос являются ли гены бтиЛО горячими точками инсерций МЭ. Исследовали перемещение конструкции 2, полученной на основе Р элемента, на модельной системе . Выявление мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтиЛО позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль мобильных элементов в процессах микроэволюции и адаптации. Р элемент является одним из наиболее хорошо изученных эукариотических транспозонов в ряде работ используется его способность перемещаться в близкорасположенные сайты с увеличением числа копий и сохранением стартового элемента. Такие особенности локальных перемещений можно использовать i viv для получения транспозиций в гены бтш методом Ринссрционного мутагенеза. Целью данной работы было выявление специфичности встраивания Р элемента в локус, кодирующий белки БТШ у дрозофилы исследование влияния инсерций Р элемента на функционирование генов бтиЛО рассмотрение роли различных семейств генов ТШ в адаптации к гипертермии. Разработать экспериментальный подход для регистрации и точной локализации инсерций конструкции на основе Р элемента 2 в район генов, кодирующих БТШ i . Локализовать иисерции 2. Исследовать влияние инсерций 2 на функционирование генов бтшЮ на уровне транскрипции и трансляции. Рассмотреть влияние инсерций 2 в гены бтшЮ на термоустойчивость и плодовитость потомства трансгенных линий. Изучить вклад низкомолекулярных белков теплового шока нмБТШ в формирование термоустойчивости на примере трансгенных линий и представителей других видов i. ГЛАВА 1. Помимо генов, постоянно транскрибирующихся или закономерно включающихся и выключающихся в процессе нормальной жизнедеятельности клетки, существует специфическая группа генов, расположенных в разных хромосомах, активирующаяся при воздействии различных стрессовых факторов, в частности, при повышении температуры выше физиологической на 5 С тепловой шок, ТШ и др. ТШ. В стрессовых условиях продукты этих генов, белки теплового шока, повышают устойчивость клетки и защищают ее благодаря предотвращению необратимой агрегации белков и последующему протеолизу поврежденных белков. В нестрессовых условиях БТШ выполняют множество жизненно важных функций в клетке фолдинг и транспорт новосинтезированиых белков, активацию специфических регуляторных белков, деградацию белков участвуют в процессах внутриклеточной сигнализации и в клеточном апопгозе. К настоящему времени гены и белки теплового шока обнаружены во всех изученных организмах Маргулис Б. А., Ульмасов Х. Многие гены ТШ и их продукты объединены в семейства на основании гомологии их последовательностей и по молекулярному весу продуктов см. У эукариотических организмов многие семейства содержат несколько членов, различающихся по степени индуцибельности, внутриклеточной локализации и функциям. Например, семейство БТШ у человека содержит генов . ii генов . i. i до 9 генов .