Сравнительное исследование взаимодействий РНК-полимераз термофильных и мезофильных бактерий с нуклеиновыми кислотами

• Автор: Кульбачинский, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 173 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структу ра РНКполнмеразы и механизмы инициации транскрипции

Общая схема транскрипционного цикла, промоторы

Структура корфермента бактериальной РНКП и РНКП II дрожжей.

Модель элонрационного комплекса.

Конформационные изменения корРНКП в процессе элонгации транскрипции

Структура холофермента РНКП.

Механизмы взаимодействия РИКИ с промоторами.

Факторы, влияющие насилу промоторов. Различные типы промоторных комплексов
Нестабильные промоторные комплексы.
Характеристика промоторных комплексов различных бактериальных РНКП
Глава 2. Использование аптамеров в исследованиях структуры и функций белков
Методы отбора и основные характеристики аптамеров.
Методы анализа аптамербелковых комплексов
Аптамсры к белкам, взаимодействующим с нуклеиновыми кислотами i viv.
Аптамеры к белкам, связывающим ДНК и РНК сиквенсспецифически
Аптамеры к белкам, не специфически взаимодействующим с нуклеиновыми кислотами.
Структурные особенности аптамеров.
Специфичность аптамеров.
Воспроизводимость X.
Эпитопы, узнаваемые аптамерами
Направленный отбор аптамеров
Структура комплексов аптамеров с белкамимишенями.
Воздействие аптамеров на конформацию белковмишеней.
Практическое применение аптамеров.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Бактериальные штаммы, плазмиды
Электрофорез нуклеиновых кислот в деиатурирующем геле
Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
Электрофорез белков в денатурирующем геле.
Полу чение промоторных фрагментов ДНК.
Получение радиоактивномеченых олигонуклеотидов.
Конструирование мутаций в субъединицах РНКП.
Выделение асубъединнцы РНКП
Выделение корфермента РНКП.
Реконструкция РНКполимеразы i vi.
Получение ковалентных сшнвок РНКП с олигону клеотидами
Картирование сайтов ДНКбелковых сшнвок.
Транскрипция i vi
Эксперименты с минимальным нуклеиновокислотным каркасом.
Футпринтинг перманганатом калии
Получение аптамеров к корРНКП.
Измерение Кд комплексов олигонуклеотидов с РНКП
Измерение кинетики диссоциации комплексов аптамеров с корРНКП.
Футпринтинг гидроксильными радикалами
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Глава 1. Исследование взаимодействий РНКП с олигонуклеотидами из
области промоторов
Взаимодействие РНКП с короткими однонитевыми олигонуклеотидами
модель узнавания промотора.
Взаимодействие с рсубъединицей РНКполимеразы вызывает информационные
перестройки стсубъединицы.
Сиквенснеспецифическое взаимодействие олигонуклеотидов с корРНКП
Сходства и отличия свойств открытого комплекса и комплекса РНКП с нематричным олигонуклеотидом.
Глава 2. Идентификация сегмента Рсубъсдиницы РНКПГ. i, взаимодействующею с передним дуплексом ДНК в транскрипционных комплексах
Конструирование мутаций в Рсубъединице РНКП
Активность РНКП с мутациями в Рсубъединице.
Вставка шести остатков гистидина в 7 положении рсубъединицы Ш частично
недоступна дня узнавания.
Делении Д1 и Д2 влияют на стабильность минимальных элошациониых комплексов
Г лава 3. Сравнительное исследование транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий.
Температурная зависимость активности I I , и
РНКП , и различаются по скорости синтеза РНК при низкой температуре
асубъединицы и неспособны обеспечивать инициацию транскрипции
при низких температурах
Плавление промоторов РНКП , и
Стабильность промоторных комплексов РНКП , и .
Выявление районов, ответственных за различия в свойствах осубъединиц и
Температура открывания промотора определяется
консервативными районами 1 и 2 осубъединицы
Консервативный район I асубъединицы важен для стабилизации
промоторных комплексов
Взаимодействие мозаичных субъединиц с корферментом .
Заключение.
Глава 4. Однонитсвые ДНКаптамсры к корРНКП новые высокоспсиифичиые лиганды к различным эпитопам фермента
Неспецифические взаимодействия РНКП с олигонуклеотидами.
Аптамеры к РНКП .
Отбор аптамеров к корРНКП
Основные характеристики аптамеров к РНКП
Влияние i на взаимодействие аптамеров с РНКП.
Аптамеры взаимодействуют с перекрывающимися, но различными сайтами
внутри главного канала РНКП
стсубъединица и фактор ОгеВ подавшот взаимодействие аптамеров
с корферментом.
Аптамеры к РНКП Тац.
Отбор аптамеров к корРНКП Тац. Основные характеристики аптамеров
Комплексы аптамеров с РНК Тац имеют различную структуру
7субъединица подавляет взаимодействие аптамеров с корРНКП Тац
по аллостерическому механизму.
Хояофермент РНКП не способен связывать МК
Заключение
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БЛАГОДАРНОСТИ.
ПРИЛОЖЕНИЕ А .
ПРИЛОЖЕНИЕ Б.
ПРИЛОЖЕНИЕ В
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Глубже в главном канале локализуется центр связывания рифампицина. Снизу канала расположен домен субъединицы, получивший название зажима . В правой части зажима имеется характерный мотив из двух схспиралей соiiмотив, у основания которого располагается петля образованная консервативным районом С субъединицы, которая направлена в сторону верхней стенки главного канала. Этот элемент структуры был назван шипом . Неподалеку от шина располагается еще одна петля, названная крышкой i. Наконец, еще правее и ниже обнаруживается третья петля застежка i. С правой стороны главный канал ограничен доменом подвижная заслонка xi субъедииицы. Общая архитектура дрожжевой 1I II оказываегся очень похожей на структуру бактериального фермента. Пять субъединиц РНКП II , 2, 3, 1 и 6, гомологичны, соответственно, , , , , и субъединицам бакгериальной РНКП. Эги субъединицы образуют серщевину молекулы РНКП. На периферии обнаруживаются еще пять субъединиц 5, 8, 9, и 2. Две из них 9 и 5 удлиняют клешни РНКП в левой части главного канала, что приводит к появлению структуры, названной челюстями , а остальные заполняют имеющиеся полости на поверхности фермента. Сравнение последовательностей разных РНКП показывает, что наиболее консервативные участки ралоложены вокруг активного центра фермента, а неконссрвативиыс районы на периферии молекулы рис. Е. Структурная гомология бактериальной и эукариотических РНКП простирается гораздо дальше, чем шмология аминокислотных последовательностей . Структура активного центра оказывается практически идентичной в случае разных РКП , . Было обнаружено, что большинство доменов главных субъединиц гомологов а, , и со имеют сходную архитектуру у обоих ферментов i, . В составе Р1К1 II удается найти многие характерные элементы, присущие бакгериальной РНКП мостовую спирать, зажим, шин, крышку, застежку, подвижную заслонку которая в случае РНКГ II полупила название стенки, , и iii названные выступомидолей, i и . Биохимическими методами было установлено, что в элонгационом комплексе РНКГI взаимодействует с различными участками транскрипционного пузыря с двунигевой ДНК спереди и сзади по ходу транскрипции примерно от до положения, с нематричной цепью ДНК. РНКДНК гибридом и однонитевой 1I, выходящей из комплекса примерно до длины нт Общая длина расплавленного участка ДНК в элонгационном комплексе составляет нт. РНКДНК гибрида нт. Некоторые из НКбслковых контактов оказываются особенно важными для стабильности элонгационного комплекса. Было показано, что для образования стабильного комплекса необходимо и достаточно присутствие переднего дуплекса ДНК длиной как минимум 9 п. РНКДНК гегеродуплекса длиной 8 п. Сразу же после расшифровки структуры корфермента РНКII стало ясно, что ДНК и РНК в элонгационном комплексе должны располагаться внутри главного канала РНКП . Поверхность главного канала РНКП содержит большое количество положительно заряженных аминокислотных остатков, что должно обеспечивать выюдные электростатические взаимодействия с нуклеиновыми кислотами рис. Г и Д , . Вскоре была проведена систематическая работа по картированию ДНК и РНКбелковых контактов в элонгационном комплексе с использованием РНКП . РНКДНК конструкций. Полученные данные были спроецированы па грехмерную струкгуру корРНКП Т. В полученной модели элонгационного комплекса РНКДНК гетеродуплекс помещается между каталитическим ионом 2 и мостовой спиралью с одной стороны и шипом с другой рис. РНКтранскрипт в районе зретьегопятого нуклеотидов проходит около рифампицинсвязывающего кармана субъединицы. РНК располагается около активного центра РНКП, а задняя часть РНКДНК гибрида, повидимому, удерживается шипом и крышкой субъединицы. Предположено, что оба элемента шип и крышка могут также принимать участие в разделении цепей РНК и ДНК. Выходящая из гетеродуплекса РНК проходит между подвижной заслонкой и основным телом фермента этот участок получил название канала выхода РНК, рис. Передний дуплекс ДНК п. Нематричная цепь ДНК в расплавленной области помещена между доменами и 2 субъединицы.