Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов

• Автор: Степаненко, Василий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.
Глава 1.

Интеины механизм, распространение, эволюция и применение.

1.1. Введение.

1.2. Особенности первичной структуры интеинов.

1.3 Механизм белкового сплайсинга.

1.3.1 Канонический механизм белкового сплайсинга.

1.3.2 Белковый транссплайсинг.

1.3.3 Автопроцессинг белков семейства.

1.3.4 Белковый сплайсинг в интеинах, содержащих нетипичные аминокислоты в консервативных доменах.
1.4 Факторы, влияющие на реакцию белкового сплайсинга.
1.5 Эндонуклеазные домены интеинов.
1.5.1 Особенности первичной структуры.
1.5.2. Хоуминг интеинов.
1.6 Распространение и эволюция интеинов.
1.7 Применение белкового сплайсинга в биотехнологии.
1.7.1 Экспрессионные системы на основе интеинов для очистки и модификации рекомбинантных белков.
1.7.2 Реакция лигирования синтезированных белков.
1.7.3 Белковый транссплайсинг и применение составных интеинов в биотехнологии.
1.7.4 Применение интеинов для посттрансляционной активации белков.
1.7.5. Перспективы применения интеинов для очистки рекомбинантных белков и пептидов в промышленных масштабах. Глава 2.
Применение интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов.
2.1 Введение.
2.2 Использование интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов с концевым серином на примере тимозинаа1.
2.2.1 Применение векторных систем на основе V интеина.
2.2.2 Применение векторных систем на основе мутантного V интеина.
2.2.3 Создание и применение модифицированного миниинтеина.
2.3 Использование миниинтеина для получения рекомбинантных полипептидов с концевым гистидином.
2.3.1. Применение миниинтеина для получения рекомбинантого глюкагона.
2.3.2 Оптимизация третьего способа получения глюкагона.
г
2.3.3 Применение миниинтеина для получения рекомбинантого оксинтомодулина.
2.4 Применение миниинтеина для получения рекомбинантого эпидермального фактора роста человека и исследование влияния ингеиновой части гибридного белка на рефолдинг целевого полипептида.
Глава 3.
Материалы и методы.
3.1. Реактивы.
3.2. Ферменты.
3.3. Материалы.
3.4. Препараты.
3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды.
3.6. Бактериальные штаммы.
3.7. Плазмидные векгора.
3.8. Лабораторное оборудование.
3.9. Буферы и растворы.
3 Методы.
. Электрофорез белков в ПААГ.
. Приготовление компетентных клеток и их трансформация.
. Определение концентрации белка.
. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.
. Отбор рекомбинантов при помощи гибридизации на нитроцеллюлозных мембранах.
. Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сенгера.
. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
. Амплификация ДНК i vi.
. Извлечение ДНК из геля.
3. Молекулярное клонирование.
3. Выделение гибридного белка в растворимой форме.
3. Расщепление гибридного белка на хитиновом сорбенте.
3.олучение гибридного белка в виде телец включения.
3. Солюбилизация телец включения.
3. Расщепление гибридного белка в растворе.
3. Препаративное получение глюкагона.
3. Ренатурация и автокаталитическое расщепление .
Первая схема
Вторая схема
Выводы.
Благодарности.
Список литературы


Важным аспектом белкового сплайсинга является то, что реакции лежащие в его основе встречаются и в других формах белкового процессинга от расщепления пептидной связи до связывания с небелковыми субстратами. Некоторые из этих особенностей могут быть результатом сходящейся эволюции, но, по крайней мере, авгоироцессинг белков семейства НИ является, бесспорно, эволюционно родственным белковому сплайсингу. Особо стоит отметить, что элементы белкового сплайсинга обнаружены только в одноклеточных организмах, где их распространение имеет все признаки паразитических генетических элементов, тогда как близко родственные белки семейства НЬ обнаружены только у животных, где они выполняют крайне необходимую регуляторную функцию в раннем эмбриональном развитии. Понимание эволюции и функции интеинов осложняются тем, что большинство интеинов включает в себя эндонуклеазы рестрикции, что превращает интеины в своего рода
паразитические элементы за счет горизонтального переноса интеинкодирующих областей, возможно даже между видами 2. Хотя обнаружено только около 0 потенциальных случаев белкового сплайсинга и множество интеиноподобных последовательностей, как способных, так и не способных к белковому сплайсингу, они встречаются на всех трех уровнях жизни археа, бактерии и эукариоты наводя на мысль о эволюционно древнем происхождении этих доменов 3. Особенности первичной структуры интеинов. Все структурные и каталитические элементы, необходимые для осуществления реакции белкового сплайсинга, находятся в последовательности интеина и нескольких экстеиновых остатках, граничащих с участками разрезания и лигирования 2, 3. Длина всех известных на сегодня интеинов составляет аминокислотных остатков 6. На сегодняшний день обнаружено несколько типов интеинов. Это канонические интеины и миниинтеины, в которых отсутствует центральный эндонуклеазный домен рис. В обоих типах интеинов и Сконцевые участки обладают высокой гомологией. Длина концевого домена составляет около 0 0 аминокислотных остатков, Сконцевого меньше . В ходе анализа интеиновых последовательностей был выявлен ряд консервативных мотивов, характерных для большинства интеинов 3, 5, 7. В терминальном домене выделяют 2 консервативных блока А и В в Стерминальном и эндонуклеазном соотвегственно , и С, , Е, Н рис. Амотив короткий мотив на конце интеина, состоящий из аминокислотных остатков а. Практически всегда на конце интеина находится . Очень редко в первом положении могут находится , i или . Высокая консервативность аминокислот на конце в Амотиве объясняется их важность для инициации сплайсинга 3. Яншин а. Инмеии а. Рис. Схематическое строение основных типов интеинов 8. Мотив 2 состоит из 7 а. Причем, или в положении 5 является консервативными. Вмотив отделен от мотива А линкером длиной в а. Чаще всего рядом с ним, в положении 7, находится аминокислота 5. Мотив 4 состоит из а. В положении , как и у Шмотива, находится остаток . Однако в отличии от Кт2мотива, 4 обнаружен не у всех интеинов отсутствует у V, V, Сеи и др. Мотивы А, 2, 4 и В формируют концевой сплайсинговый домен. Общая длина концевого домена составляет около а. Смотив и Емотив обычно содержат додекапептидные мотивы I, являющиеся характерной чертой эндонуклеаз семейства и 2 соответственно 6, 9. Последовательности длиной 9 и а. ДНК, и разделены линкером, состоящим приблизительно из 0 а. Н мотив состоит из а. Мотивы С, , Е, Н формируют эндонуклеазный домен, который присутствует в канонических интеинах. Основная роль этого домена поддержка генетической мобильности ДНКпоследовательностей, кодирующих интеины. В некоторых интеинах вместо эндонуклеаз семейства представлены эндонуклеазы класса ii. Известны интеины , Мхе , , не содержащие блоков С, , Е, Н, но способные к белковому сплайсингу т. Мотивы и формируют Сконцевой автокаталический домен. Общая длина Сконцевого домена составляет а. Характерно, что и мотивы разделены очень небольшим линкером, обычно от 2 до 5 а. Сконцевой последовательностью, состоящей из 8 а. Сэкстеина. Последняя аминокислота интеина практически всегда очень редко i, а предпоследняя i, они являются высоко консервативными в большинстве интеинов 5, 7. Первая аминокислота во всех известных Сэкстеинах 1 аминокислота , или .