Фаговый дисплей как универсальный метод исследования белковых взаимодействий

• Автор: Миненкова, Ольга Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 230 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

писок принятых сокращений

ведение

лава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Л .Технология фагового дисплея

.2. Структура и биология нитчатого фага.

.3. Пептидные библиотеки

.4. Дисплей пептидов и белков в составе фаговых белков i и VIII.

.5. Минорные фаговые белки VI, VII и IX

.6. Модификация фага М для дисплея

.7. Фаговые библиотеки несвободной структуры

.8. Области применения фагового дисплея.
.9. Ограничения дисплея, основанного на нитчатом фаге.
Система литических бактериофагов.
Бактериофаг Т4.
Бактериофаг Т7.
Бактериофаг лямбда.
Дисплей на основе белка V
Дисплей на основе белка
Новый дизайн векторов для библиотек кДНК.
Применение фагового дисплея, основанного на бактериофаге лямбда
Заключение.
лава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
лава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
.1. Получение жизнеспособных вариантов фага М, экспонирующих на своей
овсрхности чужеродные пептиды в составе основного белка оболочки VIII
. 2. Новая концепция для разработки теста на наличие в сыворотке крови антител
ротив вируса гепатита С
.3. Идентификация опухолевых антигенов путем скрининга библиотек кДНК,
спонированных на поверхности фага лямбда, с помощью сывороток пациентов.
.4. Новые векторы для дисплея рекомбинантных антител на основе нитчатого фага
лава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
писок публикаций.
лагодарности
писок литературы
ПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Г антиген
о. аминокислотный остаток С А бычий сывороточный альбумин ИЧ вирус иммунодефицита человека ДНК двухцепочечная ДНК ин минута
КА моноклональные антитела ДНК одноцепочечная ДНК АГЭ полиакриламидный гель электрофорез .о. пара оснований ЦР полимеразная цепная реакция ЭГ полиэтиленгликоль Ф репликативная форма ДНК к секунда час
ДТА этилсндиаминтетрауксусная кислота
рампициллин
ЕА iii i
i ii i
диметилсульфоксид
I i i , иммуноферментный анализ x эмбриональная бычья сыворотка i поверхностный антиген вируса гепатита В С тяжелая пень антитела V вирус гепатита С IV вирус иммунодефицита человека iv ii i канамицин С легкая цепь антитела АР i ii i . . оптическая плотность
II минорный белок оболочки нитчатого бактериофага III основной белок оболочки нитчатого бактериофага i i
сайт связывания рибосомы v ii v i додедил сульфат натрия
X i iiii i i xi i v i i i i опухолевый антигены
i i
И вариабельный район тяжелой цепи антитела вариабельный район легкой цепи антитела дикий тип
Введение


Интенсивное изучение фага М и шраничения связанные с дисплеем на основе елка VIII привели к попытке улучшить данную систему дисплея i, . VIII, однако плотность дисплея часто ставляет менее одной молекулы на фаговую частицу i . IV, рХ1 и i. VIII. Для разрешения этой проблемы, кие белки, как человеческий гормон роста и стреитавидин, были встроены в ген белка 1 i . Затем библиотека мутантов белка VI подвергалась аффинной лекции, после чего были отобраны варианты VIII, увеличивающие эффективность сплся обоих белков практически в 0 раз i . VIII . Открытие возможности существенной дификации белка VIII привела к селекции такого варианта, который встраивался в аговый капсид в обратной ориентации i i, , разрешая дисплей инных полипептидов на Сконце белка VIII. В последующих работах были ентифицированы 9 а. VIII, которые были необходимы и достаточны для аковки этого белка в фаговый капсид . Большинство фаговых библиотек построено путем генетической встройки птидов в конец белка VIII либо i. Хотя структура фагового капсида может кладывать какието конформационные ограничения на пептид, обычно считается, что спонированный на поверхности фага иеншд принимает те же возможные нформационные состояния, что и в растворе. Это, с одной стороны, увеличивает роятность нахождения подходящего лиганда практически для любой молекулыишени, а с другой стороны, увеличивает энтропию системы, затрудняя селекцию. Для лучения высоко аффинных лигандов используются библиотеки, в которых нформация экспонированных пептидов различной длины ограничивается двумя стеиновыми остатками, фланкирующими пептидную встройку i . Можно привести пример лекции пептида из подобной библиотеки, связывающего гликопротеин тромбоцитов I i . Пептид содержат консенсусную последовательность , фланкированную двумя цистеинами, при этом аффинность пептида зависела от ормирования внутримолекулярного цистеинового мостика. Библиотеки, спонирующие циклические пептиды, используют для картирования нелинейных итопов ii . Другой способ добиться той же цели, т. В этом случае площадь взаимодействия между олекулами больше, чем в случае линейных пептидов и удаленные аминокислоты дают ой вклад в энергию связывания. Для создания таких библиотек были использованы кие белки, как домен белка i . Vi . III 3 i . При этом сами они, как правило, экспрессировались в системе белка рЩ . Домен белка 3 имеет строение, сходное с иммуноглобулинами и содержит три подобных петли. При использовании высокоэффективного дисплея на основе НК, который позволяет работать с библиотеками до разных молекул, из блиотеки, основанной на 3, были получены лиганды с субнаномолярной финноегью. Впоследствии на основе этого белка была сконструирована библиотека, в торой были рандомизированы не три полных петли , а только инокислотных позиций. Такая библиотека размером 9 членов, экспонированная поверхности дрожжевых клеток, в результате афинного созревания дала лиганд с финиосгыо 0 нмоль iv . Авторы этой работы предлагают ввести стеиновые мостики для стабилизации петель и использовать аналогичную блиотску для фагового дисплея. Моноклональные антитела МКА широко используются для селекции лигандов фаговых пептидных библиотек. Хотя исследования кристаллической структуры казывают, что эпитопы реальных белков, как правило, пространственные, больший вклад в энергию связывания дает короткий линейный пептид. В лыпинстве случаев пептиды, выделенные из фаговых библиотек, несут короткий нейный район аналогичный белку, который использовался для получения МКА i . Таким образом, если существует линейный эпитоп, связывающий иное МКА с аффинностью не меньше 0 рМ, то он может быть идентифицирован с мощью процедуры биопаннинга. В связи с этим фаговый дисплей является едпочтительным инструментом для картирования линейных эпитопов . V . Кроме того, техника фагового дисплея может быть использована для ъяснсния некоторых характеристик различных МКА. Так в одной из недавно убликованных работ методом фагового дисплея было показано, что моноклональные титела, способные связывать парафинированные и фиксированные формалином срезы аней, узнают именно линейные эпитопы .