Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства

• Автор: Певзнер, Ирина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение.

Цель и задачи исследования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Определение и классификация РИБ.

1.2. Токсины из растения омела белая Vi

1.3. Строение вискумина

1.3.1. Строение Асубъединицы вискумина

1.3.2. Строение Всубъединицы вискумина

1.3.3. Взаимодействие между субъединицами вискумина

1.3.4. Димеризация вискумина.
1.4. Ферментативная активность РИБ.
1.5. Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью
сайтнаправленного мутагенеза
1.6. Биосинтез РИБ в растительных клетках
1.7. Физиологическая роль РИБ в растениях
1.8. Транспорт РИБ II в эукариотических клетках
1.9. Применение РИБ в медицине.
1.9.1. Биологическая активность экстрактов омелы и их компонентов
1.9.2. Иммунотоксины и вакцины на основе РИБ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы бактерий, плазмиды, ДНКмодифицирующие ферменты и реактивы .
2.2. Выделение нативных токсинов и их субъединиц из растения Vi
2.3. Выделение токсинов и их субъединиц из растения ii i.
2.4. Выделение геномной ДНК из растения Vi .
2.5. Клонирование гена предшественника лсктина омелы.
2.6. Клонирование фрагмента гена, кодирующего Асубъединицу токсического
лектина омелы
2.7. Клонирование фрагмента гена, кодирующего Всубъединицу токсического
лектина омелы
2.8. Анализ последовательностей клонированного гена и его фрагментов.
2.9. Предсказание антигенных детерминант в А и Всубъединицах I и III
2 Экспрессия рекомбинантных белков.
2 Выделение и очистка рекомбинантных белков
2 Ренату рация рекомбинантных белков.
2 Иммуноблотгинг.
2 Иммуноферментный анализ ИФА
2 Бесклеточная система синтеза белка.
2 Оценка углеводсвязывающсй способности рекомбинантных белков.
2 Создание мутантных форм рекомбинантных Асубъсдиниц МЫ и МЫП с помощью сайтнаправленного мутагенеза
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Клонирование гена и Анализ последовательности предшественника токсического лектина омелы
3.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектийа омелы.
3.1.2. Анализ аминокислотной последовательности Асубьединицы токсического лектина омелы
3.1.3. Анализ аминокислотной последовательности Всубъединицы токсического лектина омелы
3.2. Получение рекомбинантных субъединиц токсического лектина омелы и исследование их активности.
3.2.1. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных Асубъединиц токсических лектинов омелы
3.2.2. Предсказание антигенных эпитопов в Асубъедницах МЫ и МЫП.
3.2.3. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантной Всубъединицы токсического лектина омелы.
3.2.4. Предсказание антигенных эпитопов в Всубъедницах МЫ и МЫП.
3.2.5. Исследование каталитической активности рекомбинантных Асубъединиц токсинов омелы МЫ и МЫП
3.2.6. Исследование углеводсвязывающей способности рекомбинантной Всубъединицы токсина омелы МЫП
3.3. Создание мутантных форм рекомбинантных Асубъединиц МЫ и МЫП
Выводы.
Список литературы


Однако при использовании РИБ II в подобных прикладных целях необходимо учитывать их высокую цитотоксичность по отношению к эукариотическим клеткам. Чтобы снизить отрицательное воздействие токсинов на клеткимишени, предлагается использовать их ферментативно неактивные формы, созданные на основе рекомбинантных генов РИБ II путем внесения точечных мутаций в активный центр Асубъединиц. Получение таких форм токсических лектинов дает возможность изучать детальные механизмы транспорта РИБ II в эукариотических клетках без инактивации синтеза белка в них, приводящей к гибели клеток. Способность токсинов к трансмембранному переходу дает возможность использовать их при создании генноинженерных вакцин нового поколения как вектор для доставки в цитоплазму антигенпрезентирующих клеток различных вирусных пептидов или опухолевых антигенов для стимуляции иммунного ответа организма против вирусов и других внутриклеточных патогенов или раковых клеток. Такие конъюгированные с токсинами пептиды доставляются внутрь эукариотической клетки и презентируются в составе комплекса с молекулой МНС I, что приводит к стимуляции цитотоксических лимфоцитов, направленных против данного патогена. Целью данной работы было клонирование нового гена токсического лектина омелы III и сравнительное исследование структурнофункциональных свойств рекомбинантных токсинов I. I и III. Клонировать ген токсического лектина омелы III и экспрессировать его А и Всубъединицы в клетках ii i. Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей рекомбинантного токсического лектина омелы III и вискумина I. Изучить иммунохимичсские свойства ренатурированных рекомбинантных А и Всубъединиц I и III с помощью панели моноклональных антител против токсических лектинов омелы I, II и III. Исследовать ферментативную активность рекомбинантных Асубъединиц МП и III в бес клеточной системе синтеза белка. Исследовать углсводсвязывающую способность рекомбинантной Всубьединицы III в иммуноферментном анализе с модельным рецептором. Получить мутантные формы рекомбинантных Асубъединиц токсических лектинов омелы I и III с заменой ключевых аминокислотных остатков в активном центре ферментов, изучить вклад в каталитическую активность токсинов каждого из измененных остатков. ГЛАВА 1. Многие растения синтезируют и накапливают в семенах, зеленых частях и коре токсические белки, относящиеся к семейству рибосоминактивирующих белков РИБ. Биологические эффекты этих белков известны с давних времен вследствие высокой токсичности семян клещевины ii i и растения iv, листьев омелы Vi и коры бузины . В году X. Стиллмарк идентифицировал токсическую основу семян клещевины белок, названный рицином. С тех пор было найдено и охарактеризовано множество белков, структурно и функционально сходных с рицином. Термин рибосоминактивирующий белок был введен до того, как были изучены структура и ферментативные свойства РИБ для обозначения растительных белков, которые инактивируют рибосомы животных. После выяснения способа действия РИБ на рибосомы, это название применяется исключительно для гликозидаз. Рибосоминактивирующие белки могут быть разделены на группы на основании их строения . РИБ типа состоят из одной субъединицы с молекулярной массой кДа, проявляющей гликозидазную активность ii . РИБ были обнаружены у множества однодольных и двудольных растений. Сейчас известно около 0 видов различных РИБ I i . Наиболее известные РИБ Г бриодин из растения i ii гелонин из i i, момордин и бетамоморхарин из растения i iа антивирусный белок из фитолакки i ivi i, , сапорин из i iii и трихосантин из i i xi. РИБ II типа представляют собой гетеродимерные гликопротеины с молекулярной массой около кДа, состоящие из двух субъединиц, соединенных дисульфидной связью. Субъединица является ферментом гликозидазой, а Всубъединица проявляет лектиновые свойства и взаимодействует с углеводными остатками на поверхности клетокмишеней. За счет углеводсвязывающей субъединицы РИБ II типа являются цитотоксичными, в отличие от РИБ I i . Было найдено около видов РИБ И типа у восьми различных семейств двудольных растений, и у двух семейств однодольных.