Регуляция экспрессии мРНК мультифункционального белка p50/YB-1

• Автор: Скабкина, Ольга Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структурная организация и функциональные

активности рУВ1 млекопитающих

1. Общие свойства и доменная организация р.

2. Функции р в ядре.

2.1. Особенности взаимодействия р с ДНК.

2.2. Участие р в регуляции транскрипции.

2.3. Возможное участие р в репликации ДНК.

2.4. Участие р в репарации ДНК

2.5. Участие р в сплайсинге мРНК

3. Функции р в цитоплазме
3.1. Взаимодействие р с РНК и влияние на вторичную структуру РНК
3.2. Влияние р на трансляцию
3.3. Влияние р на стабильность мРНК .
4. Перераспределение р между ядром и цитоплазмой
5. Участие р в обеспечении множественной лекарственной устойчивости
6. р в раковых клетках
7. Регуляция экспрессии гена р
II. Посттранскрипционная регуляция
экспрессии генов с помощью факторов,
взаимодействующих с 5 и 3 НТО мРНК
1. Влияние НТО на трансляционную активность мРНК
1.1. Регуляция трансляции, связанная с 5 НТО мРНК
1.2. Регуляция трансляции с участием 3 НТО мРНК
1.2.1. Регуляция инициации трансляции, основанная на циклизации мРНК
1.2.2. Регуляция трансляции, основанная на конкуренции или
изменении соотношения белков активатора и рспрсссора
1.2.3. Регуляция трансляции специфическими РНК
2. Влияние 3 НТО на временя жизни мРНК в клетке
2.1. Механизмы деградации мРНК в клетке.
2.2. Экзонуклеазная деградация мРНК.
2.2.1. АЛЕпоследовательности и их классификация
2.2.2. АЛЕ связывающие белки.
2.2.3. Участие АЛЕсвязывающих белков в деградации мРНК экзосомой.
2.3. Эндонуклеазная деградация мРНК
2.4. Взаимосвязь стабильности мРНК и ее трансляционной активности
3. Участие 3 НТО в транспорте и локализации мРНК.
3.1. Связь трансляционной активности мРНК и ее локализации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клонирование фрагментов кДНК р с 3 НТО.
2. Выделение плазмидной ДНК из ii i.
3. Рестрикция плазмиды
4. Получение транскриптов мРНК i vi.
5. Аналитический электрофорез нуклеиповых кислот в геле агарозы.
6. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины
7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
8. Выделение и РАВР из мРНП ретикулоцитов кролика
9. Выделение глобиновой мРНК из
свободных мРНП ретикулоцитов кролика
. Бесклеточная система трансляции из ретикулоцитов кролика.
. Метод замедления подвижности РНК в геле i
. РНКбелковые сшивки под действием ультрафиолетового облучения
. Получение и очистка поликлональных
моноспецифических антител к белку р.
. Иммунологический анализ белковых препаратов
. Иммунопреципитация комплексов белков лизата
ретикулоцитов кролика с меченой РНК.
. Пришивка антител к белок Асефарозе
. Иммуноадсорбция р из лизата ретикулоцитов кролика
. Адсорбция РАВР из лизата ретикулоцитов кролика на полиАсефарозе
. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика
. Электрофорез РНК в геле агарозы в присутствии формальдегида
. Получение меченого фрагмента кДНК
. анализ
. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Влияние экзогенных фрагментов мРНК р с 5 и 3 НТО на синтез белка р в бесклеточной
системе трансляции из ретикулоцитов кролика.
2. Влияние экзогенных субфрагментов
мРНК р с 3 НТО на профиль полисом
3. Влияние экзогенных субфрагментов мРНК р с 3 НТО на стабильность мРНК
в бесклеточной системе трансляции.
4. Поиск белков, специфически взаимодействующих с
фрагментом мРНК р с 3 НТО в лизате ретикулоцитов кролика.
Ф 5. Определение мест посадки белков , , и кДа
наЗ НТОмРНК р
6. Идентификация кДа белка, специфически взаимодействующего с субфрагментом I
мРНК р с 3 НТО, как рЛГВ1.
7. Идентификация кДа белка, специфически взаимодействующего с субфрагментом I мРНК р,
как полиАсвязывающего белка РАВР.
8. Исследование влияния полиА на трансляцию
мРНК р в лизате ретикулоцитов кролика.
9. Исследование влияния природного белка р на
трансляцию мРНК р в лизате ретикулоцитов кролика
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Влияние р на стабильность мРНК . II. Механизмы деградации мРНК в клетке. Экзонуклеазная деградация мРНК. АЛЕ связывающие белки. Участие АЛЕсвязывающих белков в деградации мРНК экзосомой. Участие 3 НТО в транспорте и локализации мРНК. Связь трансляционной активности мРНК и ее локализации. Клонирование фрагментов кДНК р с 3 НТО. Выделение плазмидной ДНК из ii i. Получение транскриптов мРНК i vi. Аналитический электрофорез нуклеиповых кислот в геле агарозы. Бесклеточная система трансляции из ретикулоцитов кролика. РНК. РНК р с 3 НТО в лизате ретикулоцитов кролика. Ф 5. РНК р с 3 НТО, как рЛГВ1. Асвязывающего белка РАВР. РНК р в лизате ретикулоцитов кролика. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. БЛАГОДАРНОСТИ. Мажорный белок цитоплазматических мРНП ретикулоцитов кролика, x ii i i, является членом эволюционно консервативного семейства древних мультифункциональных ДНКРНКсвязьшающих белков с доменом холодового шока белков, распространенных от баетерий до человека viiv . У бактерий синтез целого ряда белков этого семейства, известных как мажорные белки холодового шока, активируется при понижении температуры и служит для адаптации бактерий к росту при этих условиях i, . У млекопитающих белки этого семейства регулируют клеточное деление и дифференцировку и участвуют в защите клеток от действия ионизирующей радиации и ксенобиотиков . На молекулярном уровне белки с доменами холодового шока в ядре взаимодействуют с промоторами и энхансерами многих генов и регулируют их транскрипцию . ДНК I . РНК i . В цитоплазме белки с доменами холодового шока упаковывают транслируемую и нетранслируемую мРНК и, в зависимости от количества белка на мРНК, промотируют или, наоборот, ингибируют процесс трансляции ii viiv, viv viiv, , а также стабилизируют мРНК viv . Было показано, что активация синтеза главных белков холодового шока у бактерий достигается, в основном, на посттранскрипционном уровне в результате значительной и избирательной стабилизации их мРНК . Xi . Механизмы регуляции экспрессии белков с доменами холодового шока у эукариот пока не исследовались. В то же время данные о влиянии этих белков на многочисленные клеточные процессы, зачастую меняющие свой знак с изменением количества белка на нуклеиновой кислоте, заставляют предполагать наличие строгого контроля за содержанием этих белков в эукариотических клетках, в том числе и за счет регуляции на посттранскрипционном уровне. Посттранскрипционный контроль экспрессии генов у эукариот в значительной степени связан с 5 и 3 нетранслируемыми областями мРНК НТО и специфическими белками или комплементарными РНК, взаимодействующими с этими областями i, , . Настоящая работа посвящена изучению механизмов посггранскрипционной регуляции экспрессии гена мажорного белка цитоплазматических мРНП ретикулоцитов кролика . РНК р, на трансляцию этой мРНК. УВ1 млекопитающих это мультифункциональный ДНК и РНКсвязывающий белок, член древнего и эволюционно консервативного семейства белков с доменом холодового шока. Белок имеет ядерноцитоплазматическое распределение в клетке и участвует в многочисленных ДНК и РНКзависимых процессах. Функции рУВ1 кролика и человека суммированы в таблице 1. Таблица 1. Известные функции . Кролик 1 регуляция трансляции мРНК 2 регуляция стабильности мРНК viv viiv, viv . Человек 1 регуляция транскрипции целого ряда генов 2 участие в репарации ДНК 3 участие в репликации Д1 ПС 4 участие в альтернативном сплайсинге мРНК 5 стабилизация мРНК 6 регуляция трансляции мРНК 7 ЗДНКэкзонуклеазная активность . I., i . Ii . Да, содержит большое количество ,7, и и имеет очень высокую изоэлектрическую точку около 9,5 ii . Характерной особенностью р является его аномальная электрофоретическая подвижность. При истинной молекулярной массе ,8 кДа он мигрирует как белок с массой около кДа viv viiv, . Да. Он взаимодействует с целым рядом других белков актином v . I2 i i 2, участвующим в регуляции трансляции ферритиновой мРНК i . К гетерогенных ядерных РНП гяРНП v . IV1 i . V . Рмс. Доменная организация р и функции отдельных доменов.