Сборка in vitro трех морфологических частей 30S рибосомной субчастицы Thermus thermophilus

• Автор: Железнякова, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структурные особенности ЗОБ рибосомной субчастицы

1. Краткая характеристика рибосомы

2. Структурные особенности малой рибосомной субчастицы

2.1. Первичная последовательность Б РНК

2.2. Вторичная структура РНК малой рибосомной субчастицы

2.2.3. Упаковка спиралей РНК

2.3. Структура доменов Б РНК

2.3.1. 5домен

2.3.2. Центральный домен

2.3.3. Здомен
2.4. Структурные особенности белков ЗОБ субчастицы Т. ТкегторкИна
3. Взаимодействие Б РНК с рибосомными белками
4. Изучение рибонуклеопротеидных комплексов
4.1. Самосборка
4.2. Исследование морфологических частей ЗОБ рибосомной субчастицы
4.2.1. Иерархия субдоменов РНК при сборке центрального домена ЗОБ рибосомной субчастицы ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы 4
1. Химические материалы
1.1. Реактивы и ферменты
1.2. Буферы
1.3. Среды
2. Биологические материалы
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Плазмиды и бактериофаги Методы
1. Методы генной инженерии
1.1. Выращивание бактериальных клеток и выделение плазмидной ДНК
1.1.1. Выделение ДНК из небольшого объема бактериальной культуры
1.1.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК из большого объема бактериальной культуры
1.2. Полимеразная цепная реакция
1.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
1.4. Электрофорез в геле агарозы
1.5. Лигирование
1.6. Получение компетентных клеток
1.7. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК
2. Экспериментальные процедуры при работе с фрагментами рР1 I
2.1. Транскрипция i vi
2.2. Денатурирующий гельэлектрофорез
2.3. Очистка РНКфрагментов
3. Экспериментальные процедуры при работе с рибосомными белками
3.1. Выращивание бактериальной культуры i
3.2. Выделение и очистка рибосом
3.3. Выделение рибосомных субчастиц
3.4. Двумерный гельэлектрофорез рибосомных белков
3.5. Экстракция белков рибосомной субчастицы
4. Исследование РНКбелковых комплексов
4.1. Реконструкция фрагментов РНК с рибосомными белками
4.2. Центрифугирование в плотности линейного градиента сахарозы
4.3. Седиментационный анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Клонирование фрагментов РНК
1.1. Стратегия клонирования
1.1.1. Амплификация фрагментов РНК
1.1.2. Рестрикиция векторной ДНК 9 и ДНКвставок
1.1.3. Лигирование
1.2. Трансформация рекомбинантной ДНК
1.3. Скрининг трансформанотов
2. Характеристика фрагментов РНК
2.1. Оптимизация условий транскрипции i vi
2.2. Получение РПКфрагментов
2.3. Изолированные фрагменты РНК
3. Получение и исследование комплексов фрагментов РНК с
рибосомными белками
3.1. Характеристики ЗРНПкомплекса
3.1.1 .Минимизация 3домена РНК
3.2. Характеристики ЗРНПкомплекса
3.2.1. Устранение агрегации 5домена и его комплексов с белками
3.3. Характеристики центральнодоменного РНИкомплекса
4. Определение конформации РНПкомплексов
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Введение
2. ЦДРНИ комплекс
3. 5РНП комплекс
4. ЗРНП комплекс
5. Конформация РНП комплексов, соответствующих трем доменам
8 рибосомной субчастицы Т. ТИегторЪИиь
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Рибосома сложная молекулярная машина, которая осуществляет трансляцию генетического кода в пол и пептидную цепь. Пептидилтрансферазная активность связана с субчастицей, тогда как субчастица представляет собой каркас для декодирования генетической информации, которая включает обеспечение того, чтобы пара оснований располагалась между антикодоном т РНК и кодоном м РНК 4. РНК р РНК, остальную часть13 рибосомные белки. Рибосомная РНК представляет собой ковалентнонепрерывный каркас для поддержания нативной структуры рибосомы 5, 6. Рибосомные белки помогают стабилизировать структуру РК взаимодействием с двумя и более спиральными элементами РНК. Из изучений клеток, содержащих мутантные рибосомы с измененными свойствами и из исследований блокирования антибиотиками шагов белкового синтеза, стало известно, что рибосома является динамичной частицей 7, 8. В течение элонгации, пептидной цепи и трансляции рибосомы вдоль мРНК, существует согласованность движений мРНК и тРНК точно на один кодон, осуществляемая рибосомой. Это движение должно включать разрывание и реформацию определенных контактов и представляется интересным в контексте кодонового узнавания субчастицей. Это достижение дополнено установлением изменений формы рибосомы на различных функциональных стадиях ,. Неизбежной преградой для прогресса в решении структуры рибосомы является тот факт, что на каждой стадии эволюции рибосома становилась более сложно устроенной ископаемые отложения цианобактерий и других бактерий и архей, содержащие рибосомные частицы, датируются тремя биллионами лет . С течением времени произошли эффективное корректирующее прочитывание и точный баланс между скоростью и точностью элонгации. В ходе этой стадии рибосомы также развивались размеры эволюционирующих генов, потому что способность к трансляции больших районов мРНК позволяет производить большие функциональные белки . Основные черты каждой субчастицы формируются одной высокополимерной рибосомной рибонуклеиновой кислотой, которая ассоциирована с большим числом рибосомных белков. Высокополимерная РНК малой субчастицы представляет собой ковалентно непрерывную полинуклеотидную цепь . Благодаря развитию быстрых методов секвенирования РНК, определена первичная последовательность РНК . .i наряду с РНК других бактерий и высших организмов. Первой высокополимерной рРНК, для которой установили первичную последовательность, была рРНК i , . рРНК из . рРНК . рРНК этой бактерии . Сравнительный структурный анализ первичных последовательностей рРНК из различных организмов выявил сильные различия в длине и нуклеотидном составе. Однако гомологичные рРНК имеют четко выраженные консервативные участки вторичной структуры. Повидимому, наличие таких участков должно определять принципиальную возможность специфической самоукладки, общую для всех рРНК. Не исключено, что вариации в первичной структуре могут иметь некоторое функциональное значение . Так например, еще в году в экспериментах по гетерологичной реконструкции была собрана активная субчастица из рибосомных белков и далеко отстоящих бактериальных видов . Это привело к заключению о том, что сайты для рбелков на рРНК эволюционно консервативны среди бактериальных РНК. Одним из районов РНК, участвующий в функционировании рибосомы был определен, так называемый, участок ШайнДальгарно, который включает последовательность . Зконца всех прокариотических рРНК . Важной является первичная последовательность спирали Ь24, которая связана с односпиральной петлей на ее вершине. Кетоксалирования 1 в этой петле приводит к ассоциации субъединиц . Кроме того, окклюдирование закупорка петли в субчастице гибридизацией с комплементарным дезоксиолигинуклеотидом ингибирует образование рибосомы . Еще один аспект первичной структуры РНК малой субчастицы присутствие модифицированных нуклеотидов, В . РНК модифицированных нуклеотидов идентифицированно и локализовано в последовательности . Кроме того, 9 из .