Изучение влияния концевых структурных модификаций на функции цитохромов Р450 микросом млекопитающих

• Автор: Жгун, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил

Модифицировать человека введением участка сайтспецифического протсолиза на границе мембранного и цитозольного доменов этого белка. Оптимизировать условия гетерологичной экспрессии генов рекомбинантных аналогов и в клетках . Отработать условия и этапы фракционирования и аффинной очистки рекомбинантных цитохромов. Изучить влияние введенных и Сконцевых модификаций на уровень экспрессии вариантов и в клетках . Определить параметры их взаимодействия с редокс партнерами. Микросомальные Р0 могут быть эффективно экспрессированы в клетках . РНК полимеразы фага Т7. Рекомбинантные и , содержащие Сконцевую олигогистидиновузо ал. Использование концевой аффинной группы интеин хитин связывающего домена не применимо для выделения вследствие инактивации Р0 при индукции аигопро тсолиза гибридного белка. Модификация а. А2 человека на границе пролин богатого района ПБР и А спирали обуславливает возникновение новой субстратной специфичности в отношении ироизводных резоруфина и сигмоидальной зависимости между скоростью Одеметилирования и концентрацией маркерного субстрата 7М РФ. Цитохромы Р0 1А2 кролика и 1А2 человека являются иммунологически родственными белками. В результате проведенных исследований сконструированы новые экспрессионные системы, обеспечивающие биосинтез функциональноактивных цитохромов Р0 микросом млекопитающих и в клетках . Оп тимизированы этапы экспрессии, фракционирования и очистки рекомбинантных цитохромов, исследовано влияние концевых структурных модификаций на их физикохимические и энзиматические свойства. Впервые показано, что введение мутации в область на границе концевого мембранного и цитозольного доменов способно приводить к изменению субстратной специфичности и каталитической активности этого белка. Впервые показано, что человека, компонент микросомальной монооксигеназной системы МОС млекопитающих, может эффективно сопрягаться с редуктазным доменом В , компонентом прокариотической МОС. Созданные системы продукции аналогов 1А2 человека и кролика в клетках микроорганизмов и отработанные условия экспрессии и аффинной очистки открывают перспективы для их дальнейших структурнофункциональных исследований. Например, вскгор, направляющий синтез рекомбинантного в виде гибридного белка с концевым доменом и Сконцевой олигогисгидиновой а. Р0 2В4, поскольку значительно облетает процедуру освобождения препарата рекомбинантного белка от сайтспецифических протеаз тромбина, фактора Ха Прозоровский, . Разработанные системы экспрессии в клетках бактерий и дрожжей могут найти применение для проверки компьютерных предсказаний новых лигандов потенциальных субстратов и ингибиторов этого фермента Белкина, . Введенние Сконцевых олигогистидиновых а. Поэтому плазмиды, обуславливающие их экспрессию, могут быть использованы для эффективной наработ ки и очистки мутантов с интересующими точечными заменами. Такие белки можно направленно иммобилизовать на поверхности электродов и микрочипои i, , . Ото открывает новые возможности для разработки биосенсоров на основе Р0 и исследования процессов комплексообразования цитохромов с редокс партнерами методами поверхностного плазменного резонанса Ivv, , . ГЛАВА 2. Цитохромы Р0 . Гены обнаружены в геномах организмов всех таксономических групп , . Их число сильно варьирует, от одного нескольких цитохромов, специализированных для проведения определенных реакций, до нескольких сотен, как в геноме . Р0 крайне разнообразны, уровень гомологии в ряде случаев не превышает . Однако их коровая структура сохранилась неизменной в ходе эволюции. Р0 являются гемтиолагными белками. Наиболее консервативные районы отвечают за связывание гема и общие каталитические свойства, самое важное из которых определяется полностью консервативным а. Этот остаток служит пятым аксиальным проксимальным лигандом гемовою железа, позволяя катализировать разнообразные химические реакции. Канонический РГ v, получает электроны от НАДФН через белокпосредник. Такая система катализирует активацию молекулярного кислорода, регио и стерсосцецифически окисляющего субстрат. Несмотря на то, что Р0 всегда осуществляют окислительное гидроксилирование 2. I2 2.