Высококонтрастные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка

• Автор: Суслова, Екатерина Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I. Зеленый флуоресцентный белок и его свойства

1.П. Генетически кодируемые сенсоры на основе

1.П.1. Са чувствительные сенсоры

11.1. Са2 сенсоры на основе акворина

11.2. Са2 сенсоры

Т.П. 1.3. Са2 сенсоры на основе

12. Сенсоры киназной активности

1.П.2.1. сенсоры киназной активности

12.2. Сенсоры киназной активности на основе
1.П.З. сенсоры касназной активности
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
П.1. Материалы и оборудование
Методы исследования
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III.I. Разработка высококонтрастных Са2 сенсоров
II.I.1. Адаптирование а.о. окружения хромофора Г 2 в составе Са сенсоров
ПТ.1.2. Оптимизация ядра Са2 сенсоров
1.1.3. Тестирование и i vi
ПТ.1.4. Тестирование и в живых клетках
1.1.5 Получение и тестирование митохондриатьной и мембранной версий
1.1.6. Сравнение 2 с химически синтезированными индикаторами Са2
ГП.П. Разработка сенсоров активности протсинкиназы А
1Г11. Оптимизация длин линкерных последовательностей
П12. Тестирование 2 i vi
I.II1. Подбор эффективных донорноакцепторных пар флуоресцентных белков и создание на их основе сенсоров протсолитической активности
Ш.Ш.1. ЕЯЕТпара РБСТРрЫУРР
III Разработка высококнтрастных ЕЯЕТсенсоров активности каспазы3
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Достаточно широкое распространение получило создание ГКС на основе эффекта безызлучагельного переноса энергии возбужденного состояния флуорофора одного донорного на другой акцепторный. Альтернативный подход основан на использовании так называемых пермутированных вариантов флуоресцентных белков i i, в которых на уровне гена нативные и С концы белка соединены друг с другом, а новые концы образованы в другой части белка. Однако, несмотря на значительный потенциал ГКС в качестве инструментов для изучения различных процессов в живых клетках, разработанные ранее ГКС обладают рядом недостатков, затрудняющих их практическое применение. Одной из основных проблем является низкий контраст флуоресцентного ответа ГКС т. Для РЯЕТиндикагоров выраженный в долях или контраст отражает изменение отношения флуоресценции акцептора к донору после срабатывания сенсора. Аналогичным образом проводят оценку контраста так называемых ратиометрических индикаторов, характеризующихся аналитзависимым изменением соотношения пиков возбуждения флуоресценции. Применительно к срРРсодержащим сенсорам с одним пиком возбуждения и эмиссии флуоресценции контраст соответствует степени изменения интенсивности эмиссии флуоресценции после взаимодействия с аналитом. Помимо невысокого контраста подавляющее большинство описанных ранее ГКС обладает также недостаточной яркостью флуоресценции, что делает их малопригодными для высокопроизводительных скринингов и ограничивает чувствительность во внутриклеточных экспериментах. Целью данной работы стала разработка высококонтрастных ГКС на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка ОРР. ГЛАВА 1. Первая часть обзора литературы содержит общую информацию о характеристиках . Приведены данные по его структуре, физическим и спектральным свойствам, а также механизму формирования хромофора. Вторая часть обзора посвящена анализу разработанных ранее ГКС на основе подобных белков. Представлена сравнительная характеристика современных Са1 чувствительных индикаторов как с использованием эффекта , так и на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков , а также сснсоров активности киназ и внутриклеточных каспаз. I.I. Первое упоминание о относится к году, когда было показано, что для светящихся клеток медузы Лссиогеа Vii характерна флуоресцентная эмиссия зеленого света при облучении в УФ области спектра v i, . Несколько лет спустя был описан белковый экстракт, способный к такой же флуоресценции . ii . Позднее этот белок был назван i, зеленый флуоресцентный белок. дикого типа это компактный, глобулярный белок, имеющий нзоэлектрнческую точку в кислой области . Молекула состоит из 8 а. Да. Пространственная структура представляет собой 3бочонок, образованный 3слоями, окружающими хромофор белка, расположенный вблизи геометрического центра молекулы рис. Третичная структура благодаря своей компактности создат оптимальные условия для защиты хромофора от внешних воздействий, чем объясняется крайне высокая стабильность флуоресценции , его устойчивость к действию протсаз, изменению и температуры . настолько устойчив, что может храниться в течение нескольких месяцев при комнатной температуре в сахарозных буферах без антимикробных агентов, так как не подвергается расщеплению бактериями и грибами. Тм температура, при которой интенсивность флуоресценции составляет от максимальной для Vii составляет С , 1. Рисунок 1. Трехмерная структура рбочонка в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Небольшие аспиральные участки закрывают рбочонок с торцов. Дикий тип . Спектры эмиссии флуоресценции для этих двух пиков возбуждения совпадают. Максимум флуоресценции приходится на 8 нм . Квантовый выход этой системы чрезвычайно высок и составляет 0. i . Рисунок 2. Спектры возбуждения синий и эмиссии зеленый флуоресценции СРР.