Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом

• Автор: Романенкова, Майя Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом. 1

1.2. Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов.

1.2.1. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевампереносчикам.

1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов

1.2.3. Синтез вирусной РНК и созревание вирионов

1.3. Диагностика ГЛПС

1.3.1. Метод флюоресцентных антител.

1.3.2. Иммунопероксидазное окрашивание.
1.3.3. Иммуноферментный анализ
1.3.4. Иммунохроматографические тесты.
1.3.5. Полимеразная цепная реакция
1.3.5.1. ОТПЦР, гнездовая ОТПЦР.
1.3.5.2. ГИДР в реальном времени.
1.3.5.3. ЛЦР в реальном времени
Г лава 2. Объект и методы исследований
2.1. Краткая характеристика объектов исследований.
2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.3. Аналитический гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.
2.4. Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей
2.5. Синтез кДНК.
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
2.7. Фосфорилирование 5концов олигонуклеотиды ых праймеров
2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотидных дуплексов и определение их температуры плавления.
2.9. ЛЦР или ОТЛЦР в режиме реального времени.
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Реактивы и материалы.
2 Составы использованных стандартных растворов.
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
3.1. Реакции с плазмидной ДНК
3.1.1. Характеристика объекта исследований
3.1.2. Проверка плазмиды II на наличие вставки.
3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени
3.1.4. Проведение ПЦР и ЛЦР с оптимизированными параметрами реакций
3.2. Проведение ОТПЦР и ОТЛЦР на синтетической матрице
3.2.1. ПЦР с I и X.
3.2.2. ЛЦР с I и X.
3.3. ГГЦРРВ и ЛЦРРВ с препаратами, содержащими вирусную РНК
3.3.1. Реакции с построением кДНК.
3.3.1.1. ОТПЦР с .
3.3.1.2. ОТПЦР с Vv
3.3.2. Реакции на РНКматрице.
3.3.2.1. ЛЦР на РНК четыре праймера
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Основными переносчиками ГЛПС являются мышевидные грызуны. Передача вируса от грызуна к человеку происходит, в основном, воздушнокапельным путем. К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и лечения ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в Республике Башкортостан характеризуется эпидемическими вспышками каждые 34 года. Подобные вспышки, вероятно, связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов хантавирусным серотипом РШ, основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории Республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Самый высокий подъем заболеваемости ГЛПС за лет с начала регистрации инфекции в Башкортостане пришелся на эпидемический сезон гг. ГЛПС, из них случая 0,4 со смертельным исходом Нургалеева и др. Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу РЦи, однако большой интерес представляла генетическая характеристика данного вируса. Эффективность лечения любого заболевания определяется его правильной и ранней диагностикой. Для диагностики ГЛПС в лабораторной практике используются методы, основанные на детекции специфических антител. В то же время достоверные результаты можно получить только при использовании техники амплификации нуклеиновых кислот. Уже ставший рутинным при проведении научных исследований метод обратной транскрипции полимеразной цепной реакции ОТПЦР трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала. ПЦР до получения конечного результата. При этом, с применением термостабильной ДНКполимеразы i полимеразы, появилась возможность проводить построение кДНК и последующую ее амплификацию в одной пробирке , , , опять же, значительно сокращая время проведения реакции. РНК в биологических материалах на основе полимеразной и лигазной цепных реакций ПЦР и ЛЦР с использованием эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции. Определить физикохимические свойства объекта исследования, провести компьютерный дизайн флуоресцентно меченых и модифицированных олигонуклеотидных праймеров, необходимых для экспериментов с использованием ПЦР и ЛЦР. Провести модельные эксперименты с выбранными праймерами с использованием ПЦР и ЛЦР, с целью подбора оптимальных параметров реакции при максимальном сокращении затрат времени. Определить эффективность использования синтезированных праймеров в ПЦР и ЛЦР, совмещенных с обратной транскрипцией, при использовании в качестве матрицы вирусной РНК, выделенной из культур клеток Уего Е6, крови больных людей и легочной ткани грызуновпереносчиков ГЛПС. Определить возможность проведения ЛЦР непосредственно на РНК, исключив из реакции стадию обратной транскрипции. Научная новизна и практическая значимость. Проведенные эксперименты показали возможность создания прототипа быстрого и высокочувствительного диагностического теста на определение хантавирусной РНК в биологических препаратах с применением методов ПЦР и ЛЦР, контролируемых в режиме реального времени. Доказана возможность сближенного расположения на матрице олигонуклеотидных праймеров, используемых в процессе ПЦР и ЛЦР, с целью обеспечения высокой эффективности переноса энергии флуоресценции в паре карбоксифлуоресцеин РАМ карбоксиХродамин ЛОХ. В результате проведенных нами модельных экспериментов разработана методика проведения ПЦР и ЛЦР с помощью ферментов Т1Иполимеразы и ПЬлигазы за максимально короткое время. Показана возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Уего Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из крови мышейпереносчиков ГЛПС.