Исследование структуры хроматина млекопитающих при помощи метилазы Dam E. coli

• Автор: Буланенкова, Светлана Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

1. Введение

2. Обзор литературы

1 Структура хроматина

Уровни организации хроматина

Нуклеосомныйуровень организации хроматина

Хроматиновая фибрилла диаметром нм

Структуры хроматина высшего порядка

Гетерогенность хроматина

Позиционирование нуклеосом

Система А ТФзависимого ремоделирования

Модификации гис тонов

Некодирующие РНК
Варианты гистонов
Негистоновые белки хроматина
Метилирование ДНК
Межвидовые различия геномов
Разные состояния хроматина
Особые структуры эукариотических хромосом
Функционирование хроматина
Дозная компенсация
Поддержание структуры хроматина
Заключение
2 Анализ сгруктуры хроматина
Картирование сайтов взаимодействия ДНК с ядерными белками
Ферментативные методы анализа
Использование нуклеаз
Использование фотолиазы
И с пол ьзован ие ДНКмет илтрансфераз
Использование рекомбиназ
Неферментативние методы анализа
Физические методы анализа
Массспектрометрия
3 Использование метилазы . i
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3. Материалы и методы
Материалы
Методы
Основные протоколы
Очистка олигонуклеотидов
Наработка требуемых фрагментов ДНК методом Г1ЦР
Создание конструкции I для экспрессии гена
Препаративная рестрикция, выделение и очистка плазмид и фрагментов ДНК
Лигирование
Получение компетентных клеток . i
Трансформация . i
Пересев выросших колоний
Экспресс метод вы делен ия плазм иды
Аналитическая рестрикция плазмид
Получение препаративных количеств плазмиды
Трансфекция клеток 3Т с использованием липофектина
Транзиентная трансфекция
Снятие трансфекции
Анализ эффективности прохождения трансфекции
Получение клеточного лизата
Определение количества белка
Определении активности галактозидазы
Определение уровня транскрипции генов
Выделение суммарной РНК из трансфицированных клеток
Обработка ДНКаз о й
Синтез первых цепей кДНК
ПЦР на матрице первых цепей кДНК
Анализ активности мстил азы в клеточном экстракте
Выделение геномной ДНК
Получение препаративных количеств космидной ДНК
Гидролиз геномной и космидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Г идролиз набора фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции.
Отжиг адаптора и подложки
Лигирование адаптеров
Энзиматическое 5фосфорилированис олигонуклеотидов
Селективная амплификация фрагментов
Смена адапторов
Процедура клонирования совпадающих последовательностей
Создание ранжированного музея клонов
Амплификация плазмидных вставок
Анализ библиотеки клонов из ранжированного музея
Анализ общей чувствительности к ДНКазе I
Выделение ядер
Обработка ядер ДНКазой
Выделение ДНК из ядер
Перенос по Саузерну
Приготовление зонда для гибридизации
Гибридизация нейлоновой мембраны с зондом
4. Результаты и обсуждение
Обоснование работы
Создание конструкции для экспрессии гена метилазы
Введение


Использование метилазы . II. Получение компетентных клеток . Трансформация . Гидролиз геномной и космидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Г идролиз набора фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции. П.о. Т.п. Млн. В клеточном ядре геномная ДНК эукариот находится не в виде голой цепочки нуклеиновой кислоты, а представлена сложным и высокоупорядоченным комплексом ДНК и белков, названным хроматином. На цитологическом уровне в составе интерфазного хроматина различают участки гетсрохроматина и эухромагина. Гетерохроматин рассматривается как транскрипционно неактивная форма, он остается конденсированным на всех стадиях клеточного цикла и характеризуется пониженной доступностью ДНК для регуляторных факторов. Напротив, транскрипционно активный хроматин деконденсирован и располагается в эухроматиновых участках в ядре. На молекулярном уровне эти два состояния различаются наборами негистоновых белков, модификациями гистонов и уровнем метилирования геномной ДНК 1. Изменение уровня конденсации хроматина является важным механизмом регуляции клеточных функций, таких как транскрипция, репликация, репарация и других. Однако, несмотря на очевидную важность состояния хроматина для функционирования клетки, все исследования главным образом фокусируются на отдельных генах и примыкающих к ним участкам генома 2. В то же время закономерности организации протяженных участков генома остаются изученными недостаточно. Это приводит к заметным пробелам в понимании координированной регуляции экспрессии ансамблей генов и участия в этой регуляции высших структур хроматина. Анализ структуры хроматина основан на различной доступности ДНК и составе хроматина для ДНКмодифицирующих агентов и последующей детекции этих модификаций. К основным модифицирующим агентам относят как агенты ферментативной природы ДНКаза, микрококковая нуклеаза, эндонуклеазы рестрикции 3, так и неферментативные агенты . Недостатком этих методик является то, что модификации, вносимые перечисленными выше агентами, приводят к гибели клеток, поэтому в большинстве случаев анализ проводится на изолированных ядрах, что неизбежно вызывает ряд артефактов, возникающих в процессе выделения ядра и хроматина. В последнее время появляются работы, связанные с экспрессией генов модифицирующих ферментов, в частности ДНКазы I, в эукариотических клетках 8. Данный метод применим только к тем организмам, у которых отсутствует эндогенное метилирование аденина в последовательности . К числу таких организмов относятся vii, i и i 0, . В отличие от нуклеаз, экспрессия метилазы в дрожжах и дрозофиле не оказывала существенного влияния на жизнедеятельность организма, что значительно понижало уровень артефактов и делало анализ более достоверным , . Метилаза . Анализ в основном проводился для конкретных сайтов в составе определенной последовательности, помещаемой в разное геномное окружение. Однако в литературе отсутствуют данные о применимости данного метода для анализа структуры хроматина млекопитающих. Поэтому проверка этой возможности и разработка методологии детекции сайтов , доступных для действия метилазы, в протяженном локусе генома, представляет собой актуальную задачу. Цель данной работы заключается в разработке метода анализа структуры хроматина протяженных локусов генома млекопи тающих на примере человека с использованием метилазы . В ходе работы планировалось решить следующие экспериментальные задачи. Создание конструкции для экспрессии гена метилазы . Введение полученной конструкции в клетки человека и проверка экспрессии гена в клетках человека. Проверка наличия метилированных сайтов в геномной ДНК трансфицированных клеток. Создание библиотеки фрагментов, получающихся в результате обработки геномной ДНК метилщепящей эндонуклеазой рестрикции и принадлежащих определенному участку генома. Анализ полученной библиотеки. Проверка полученных результатов альтернативным методом анализа структуры хроматина.