Изучение клонированных последовательностей ДНК мыши, гомологичных длинной двуспиральной РНК

• Автор: Букринский, Михаил Ильич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕЛЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Двуспиральные структуры в составе

ядерной промРНК.

ГЛАВА 2. Мобильные диспергированные гены .

ГЛАВА 3. Отличные от ВДГ протяженные повторяющиеся элементы в геноме дрозофилы

ГЛАВА 4. Короткие рассеянные по геному млекопитающих повторы.

ГЛАВА 5. Эндогенные ретровирусы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирования.л
2. Выделение тотальной РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха
3. Выделение ядерной и цитоплазматической РНК
из клеток асцитной карциномы Эрлиха
4. Выделение ядерной и цитоплазматической РНК
из клеток печени и опухоли МОРС .
5. Выделение полиАчрнк из различных препаратов РНК.
6. Введение метки в РНК
7. Электрофорез РНК в агарозных гелях
8. Выделение ДНК из клеток печени мыши.
9. Элвдия фрагментов ДНК из гелей
. Выделение плазмид
. Клонирование фрагментов ДНК мыши в плазмиде рва 2
. Анализ клонированных последовательностей
. Клонирование фрагментов ДНК мыши в бактериофаге Л .1.
. Введение метки в ДНК
. Рестрикционный анализ ДНК.
. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных
и акрил амидных гелях.
. Деление цепей ДНК.
. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах.
. Гибридизация иммобилизованных на нитроцеллюлозе нуклеиновых кислот с меченными пробами.
. Гибридизация иммобилизованной на ДБМбу
маге РНК с меченными пробами ДНК
. Определение первичной структуры ДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Клонирование последовательностей ДНК мыши, гомологичных дсРНКА.
2. Природа последовательности А и ее структурная организация.
3. Природа последовательности А2 и ее структурная организация.
4. Транскрипция элементов А и А2.
ОБСУВДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. Структура и транскрипция А.
2. Структура и транскрипция А2.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Последовательности этого класса повторяются в геноме эукариотов до нескольких десятков и даже сотен тысяч раз и активно транскрибируются. Во второй половине х годов в лабораториях Хогнесса и Георгиева независимо были проклонированы последовательности генома дрозофилы, относящиеся к классу умеренно повторяющихся последовательностей. Оказалось, что эти активно транскрибирующиеся элементы, имеющие длину в несколько тысяч пар оснований и разбросанные по геному, обладают рядом свойств, сходных со свойствами бактериальных транспозонов. Эти элементы генома дрозофилы были названы мобильными диспергированнными генами ВДГ. Они ограничены прямыми повторами длиной в несколько сотен пар оснований, так называемыми длинными концевыми повторами ДКП. ДКП содержат ряд функционально значимых последовательностей, таких, как сигналы полиаденилирования, инициации и терминации транскрипции и др. Хотя функции ВДГ пока неизвестны, им приписывают важную роль в регуляции работы других генов. Несмотря на то, что в последнее время мобильные элементы активно изучаются в различных лабораториях мира, мало что известно до сих пор о мобильных элементах генома млекопитающих. Весьма актуальным представлялся поэтому поиск подобных элементов в геноме мыши. Мобильные диспергированные гены дрозофилы были проклонированы благодаря тому, что они активно транскрибируются в культуре клеток. Поэтому меченая полиАРНК служила хорошим зондом для вылавливания МДГ из библиотеки генов дрозофилы. Подобный прием не работает в случае млекопитающих, поскольку, в отличие от дрозофилы, в их геноме содержится огромное количество коротких активно транскрибирующихся повторов. Поэтому для выделения из банка фрагментов геномной ДНК мыши мобильных элементов мы использовали другой подход. В лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии АН СССР в г. РНК мыши. Было показано, что эти двуспиральные РНК дсРНК могут быть фракционированы по дшше на два класса А длинные и В короткие. Оба эти класса дсРНК гомологичны повторяющимся после довательностям, причем было продемонстрировано, что цепи дсРНКВ транскрибируются с коротких повторяющихся элементов генома. Позже было обнаружено, что из клеток дрозофилы также может быть выделена дсРНК, однако она представлена только молекулами класса А. Оказалось, что эта дсРНК гомологична ВДГ дрозофилы. Основываясь на этом мы поставили задачу проклонировать ВДГподобные элементы из генома мыши, используя в качестве зонда мышиную дсРНКА. В работе были получены клоны, содержавшие два вида таких последовательностей, названных нами А и А2. С помощью этих клонов были изучены некоторые особенности структуры и транскрипции выделенных элементов. В году Бриттен с сотрудниками, изучая кинетику ренатурации ДНК, выделенной из разных видов организмов, пришли к выводу, что последовательности генома эукариотов могут быть разделены по повторяемости на 3 класса высокоповторяющиеся сотни тысяч раз, умеренно повторяющиеся от нескольких до десятков тысяч копий и уникальные . К высокоповторяющимся последовательностям относится сателлитная ДНК, в которой короткие отрезки ДНК повторяются до нескольких миллионов раз. Эта ДНК образует в хромосомах блоки в районе теломерных и центромерных участков. Эти участки не активны в транскрипции и участвуют в основном в архитектурной организации хромосом . Ко второму классу повторов относятся рассеянные по геному умеренно повторяющиеся последовательности. По размеру они могут быть разделены на длинные повторы, длиной несколько тысяч пар нуклеотидов тыс. И те и другие рассеяны по всему геному эукариотов 2. В отличие от сателлитной ДНК, большинство умеренно повторяющихся последовательностей активно транскрибируются 6. В настоящем обзоре мы ограничимся описанием некоторых наиболее интересных на наш взгляд последовательностей, относящихся к классу умеренных повторов. В первой главе обзора описаны двуспиральные РНК, обнаруживаемые в составе ядерной РНК клеток животных. Как уже было отмечено, эти дсРНК транскрибируются с повторяющихся элементов генома, поэтому включение данной главы в настоящий обзор не случайно.