Роль лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы в регуляции трансляции мРНК

• Автор: Марданова, Евгения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 91 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Лидерная последовательность мРНТС гена кукурузы обеспечивает ффекч ивную трансляцию мРНК в клетках растений ii i в стрессовых условиях
2. Изучение эффективности функционировании 5 НТО к качестве I в системах трансляции i vi.

3. 5 НТО обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК i viv в

клетках ii i.

4. Количественная оценка вклада внутренней инициации п трансляцию моноцистронной мРНК, содержащей в 5 НТО.
5. Оценка эффективности внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой , i viv в клетках растений ii i в условиях теплового шока.
ОБСУЖДЕНИЕ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРА ТУРЫ.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящей работе применяют следующие определения, обозначения и сокращения
ген зеленою флуоресцентного белка
зеленый флуоресцентный белок
i ген глюкуронидазы .i
глюкуронидаза
НТО нстракопируемая область мРНК
1 сайт внутренней инициации трансляции
i ген алкогольдегидрогеназы кукурузы
лидерная последовательность мРНК гена алкогольдегидрогеназы кукурузы
ХВК X вирус картофеля
первый субгеномный промотор ХВК
РНК зависимая РНК полимераза ХВК
ОТПЦР обратная транскрипция с последующей полимеразой цепной реакцией
белок теплового тока
фактор 1 теплового шока ii
ген люциферазы коралла i
ген люциферазы светляков
геи бактериальной хлорамфеникол ацетилтрансферазы ген зеленого флуоресцентного белка зеленый флуоресцентный белок
ВВЕДЕНИЕ


Использование трансгенных растений в качестве биофабрик является одним из приоритетов все большего числа международных биотехнологических компаний. Однако широкое использование этого подхода сдерживается в настоящее время низкой эффективностью систем экспрессии. Причинами этого могут являться, в числе прочих факторов, низкая эффективность трансляции мРНК чужеродных генов и проявление явления посттранскрипционного умолчания генов ii ii, . РНК. Эффективные трансляционные энхансеры могут, вопервых, повысить уровень экспрессии целевого гена, а вовторых, обеспечить его специфическую трансляцию в определенных тканях или в определенных условиях внешней среды. Существенной проблемой при создании растений биофабрик является достижение высокого уровня экспрессии целевых генов в условиях роста растений, отличающихся от нормальных например, гипоксия, обусловленная затоплением, повышенная или пониженная температура, засуха и другие стрессы. Разработка технологий эффективной экспрессии генов в стрессовых условиях необходима также для конструирования трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, поскольку антистрессовый продукт должен эффективно синтезироваться именно в этих условиях. Целью настоящей работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях. Для создания этой системы мы использовали в качестве трансляционного энхаисера лидерную последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы, , эффективно транслирующегося в стрессовых условиях. Кроме обычного механизма кэпзависимой трансляции, у эукариот в некоторых случаях реализуется и механизм внутренней инициации трансляции, направляемой сайтом внутренней посадки рибосом I i i i. Впервые I был обнаружен у вируса полиомиелита. Позднее Iсайты были обнаружены в II других вирусов. Кроме вирусных, известен ряд клеточных мРНК, для которых характерна внутренняя инициация трансляции. В основном белки, транслируемые с этих мРНК, являются регуляторными некоторые ростовые факторы, транскрипционные и трансляционные факторы и др В настоящее время активно обсуждается гипотеза, согласно которой кэпнезависимая внутренняя инициация трансляции у эукариот может являться является одним из способов экспрессии генов, который функционирует в случаях, когда эффективность нормальной кэпзависимой трансляции снижается, например, при вирусной инфекции, в стрессовых условиях, канцерогенезе и апоптозе. Мы предположили, что i обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в стрессовых условиях вследствие наличия в ней Iсайта. Гипотеза о том, что обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК, была проверена экспериментально в настоящей работе и подтверждена, вклад I по сравнению с обычной кэпзависимой инициацией трансляции был определен количественно. Практической целью работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях. Анализ влияния 5 НТО гена кукурузы на уровень экспрессии целевого гена в стрессовых условиях в клетках растений ii i. Изучение эффективности функционирования 5 НТО в качестве сайта внутренней инициации трансляции в системах трансляции i vi. Оценка вклада внутренней инициации трансляции в общую эффективность трансляции мРНК, содержащей 5 НГО , в клетках растений ii i в нормальных и в стрессовых условиях. Эукариотические мРНК характеризуются двумя особенностями структуры, отличающими их от мРНК прокариот, наличием кэпструктуры на 5конце и полиА последовательности на 3 конце. Кэпструктуры на 5конце от англ. Метилированию часто подвергаются и однадве рибозы, ближайшие к 5концу. Предполагается, что кэпирование, происходящее в цитоплазме, защищает мРНК от разрушения клеточными нуклеазами и способствует ее распознаванию рибосомами. Полиаденилатполимеразе необходима мРНК в качестве затравки. Полагается, что полиаденилирование мРНК повышает ее стабильность i, , . В отличие от многих мРНК прокариот, эукариотические в частности, растительные РНК являются моноцистронными, т. Рис. АТР
у НТО ААА. Рисунок 1. Структура мРНК эукариот.