α , β-элиминирование тирозина, катализируемое тирозин-фенол-лиазой : Сайт-направленный мутагенез и ингибиторный анализ

• Автор: Барболина, Мария Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с.

1. Пиридоксаль5фосфат в роли катализатора

2. Изучение мутантных форм пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов, полученных методом сайтнаправленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, ответственных за макромолекулярную организацию белковой глобулы
3. Исследования мутантных форм пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов, полученных методом сайтнаправленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, ответственных за связывание кофактора
4. Изучение мутантных форм пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов, полученных методом сайтнаправленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, ответственных за связывание субстрата
5. Исследования мутантных форм пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов, полученных методом сайтнаправленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, принимающих участие в катализе
6. Изучение мутантных форм пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов, полученных методом сайтнаправленного мутагенеза, обладающих изменнной реакционной иили субстратной специфичностью
7. Влияние мутаций, введнных методом сайтнаправленного мутагенеза, на поведение белков

II. Изучение реакции а,3элимннирования тирозина, катализируемой тирозинфеноллиазой

1. Введение.

2. Взаимодействие тирозин феноллиазы с аналогами субстрата тирозина

3. Роль остатка серина в механизме действия тирозин феноллиазы

4. Роль остатка аспарагина 5 в механизме действия тирозин феноллиазы
5. Роль остатка треонина 4 в механизме действия тирозин феноллиазы
6. Выводы
III. Методы исследования.
1. Выделение одноцепочечной ДНК
2. Проведение сайтнаправленного мутагенеза
3. Получение компетентных клеток .i 1
4. Трансформация, компетентных клеток .i 1
5. Выделение двухцепочечной плазмидной ДНК для секвенирования
6. Секвенирование плазмидной ДНК.
7. Получение компетентных клеток .i V0
8. Трансформация плазмидных ДНК в компетентные клетки .i V0
9. Выращивание бактериальных масс, выделение, очистка и характеристика ферментов.
. Определение белка.
. Определение чистоты выделенных ферментов.
. Определение спектров поглощения и кругового дихроизма.
. Кинетические исследования
. Синтез изотопномеченых производных 3
IV. Список цитированной литературы.
Введение


Фермент дикого типа находится в виде тетрамера и, как подчеркивают авторы , пребывает в этом состоянии не менее двух месяцев. Исследование мутантных форм фермента Ьуз1п и Ьуз6А СГМТ показало, что форма Ьув6С1п СГМТ уже при выделении находится в состоянии димера, а мутантная форма Ьуз6А СГМТ подвергается переходу тетрамер димер при хранении в течение трх недель. Поскольку эти мутантные формы хуже, чем СГМТ дикого типа, связывают кофактор, в работе сделан вывод о роли остатка ЬуБ6 не только как ПЛФсвязывающего остатка, но и как важного остатка, поддерживающего тетрамерную структуру фермента, важную для катализа. Остаток АБр серингидроксиметилтрансферазы из печени свиньи является консервативным в известных последовательностях СГМТ. Данные о кристаллической структуре фермента показали, что остаток Азр локализуется на Нконце одной субъединицы и располагается напротив остатка Ьу симметрично расположенной субъединицы, образуя прочный димер. Остаток Азр методом сайтнаправленного мутагенеза был заменн на остаток аспарагина . Очищенная мутантная форма АБрА5п СГМТ существовала в виде смеси тетрамеров и димеров, причм количество тетрамеров увеличивалось с увеличением количества пиридоксальфосфата. Тетрамерная фракция обладала той же активностью, что и фермент дикого типа. Фракция, состоящая из димеров, обладала только 5 активности серингидроксиметилтрансферазы дикого типа. По результатам исследования авторы сделали вывод, что остаток АБр участвует в поддержании олигомерной структуры фермента. Этилен эндогенный растительный гормон, регулирующий многие этапы роста и развития растений. Скоростьлимитирующая стадия биосинтеза этилена это превращение Бадснозилметионина в циклическую аминокислоту 1аминоциклопропан1карбоксильную кислоту и метилтиоаденозин, катализируемое ПЛФзависимой 1аминоциклопропан1карбоксилат синтазой КФ 4. АКС . Субъединичная структура фермента точно не выяснена. Отмечено, что фермент может быть мономером или димером в зависимости от источника его получения. В работе исследовано влияние остатков Туг и ЬуБ8 на субъединичную структуру изофермента из томатов ЬеАКС2, причем эти остатки идентичны остаткам Туг и ЬуБ8 у аспаргатаминотрансферазы, принимающим участие в связывании кофактора. У мутантов, содержащих замены остатков Туг и Ьб8 по отдельности, было отмечено значительное уменьшение активности, подтверждающее их важную роль. При соэкспрессии мутантной формы ТугЬеи АКС с мутантной формой ЬуБ8А1а АКС произошло частичное восстановление активности, подтверждающее, что отдельные субъединицы двух мутантных форм могут димеризоваться и образовывать активные гетеродимеры. Соэкспрессия двойной мутантной формы ТугЬеиЬуБ8А1а АКС с ферментом дикого типа привела к понижению активности, свидетельствующем об образовании неактивных гетеродимеров между субъединицами фермента дикого типа и двойного мутанта. АКС функционирует как димер с объединнными активными центрами. Аминолевулинатсинтаза КФ 2. Фермент существует в виде гомодимера, и были предложены две модели расположения активных центров. Согласно первой, активные центры локализуются на границе между субъединицами, а по второй активные центры расположены полностью внутри каждой субъединицы и не влияют друг на друга. А9 участвует в процессе катализа . В работе по исследованию соэкспрсссированных мутантных форм ЬуБЗЗАа и Аг9А1а 5аминолевулинатсинтазы показано, что значение Км для субстрата такое же, что и для фермента дикого типа, а активность составляет лишь от этой величины для фермента дикого типа, как и ожидалось для Ьуз3А1аАгА1а соэкспрессирующей системы. Так было показано, что 5аминолевулинатсинтаза является димером с активными центрами, расположенными на границах субъединиц, при этом активный центр каждой из субъединиц включает в себя аминокислотные остатки из обеих субъединиц. Тирозинфеноллиаза ТФЛ К. Ф. 4. Рзамещение , рацемизацию аланина и побочную реакцию трансаминирования . Природным субстратом в реакции а,рэлиминирования является Ьтирозин , а также субстратами в этой реакции являются ряд неприродных аминокислот Балкиларилцистеины, рС1Ьаланин ,.