Исследование ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта ячменя

• Автор: Ершов, Павел Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Солевой стресс и его влияние на растение.

1.1.1. Гипсросмотнческий стресс

1.1.2 Окислительный стресс.

1.2. Солеустойчивость растений

1.2.1. Клеточные детерминанты солеустойчивости

1.3. Ионный гомеостаз растительной клетки при солевом стрессе.

1.3.1. Поступление ионов натрия в клетку

1.3.2. Удаление ионов натрия из растительных клеток.

1.3.3. Компартментация ионов натрия в клеточных вакуолях

1.3.4. Поступление анионов хлора.
1.4. Поддержание ионного гомеостаза при солевом стрессе в растениях.
1.4.1. Начальное поступление в корень и удаление Иа из клеток корня
1.4.2. Контроль поступления На в ксилему.
1.4.3. Реабсорбция Ыаиз ксилемы
1.4.4. Рециркуляция Иа по флоэме из листьев обратно в корни
1.4.5. Вакуолярная компартментация Ыа в надземной части
1.4.6. Плазмалеммарный Ыа7Нантипортер в клетках листьев.
1.4.7. Накопление На в морфологических образованиях листа
1.5. Сигналы трансдукцни солевого стресса в растениях.
1.5.1. БОБ сигнальный каскад в 1каИапа
1.5.2. Сигналы трансдукцни гиперосмотичсского стресса.
ф 1.5.2.1. АБК и Са2зависимыс пути передачи стрессовых сигналов.
1.6. НаНанти портеры эукариот.
1.6.1. Сравнительный анализ функций Ыа7Нантипортеров эукариот.
1.6.2. Структурные особенности Ыа7Нанти портеров
1.6.3. Структура ЫаНантипортеров растений.
1.6.3.1. Плазмалеммарный Ыа7Нантипортер
1.6.4. Механизм функционирования Ыа7Нантипортера
1.7. Функционирование Ма7Нантипортеров в животных клетках.
Ф 1.7.1. Регуляция активности На7Нантипортеров житвотных клеток
1.8. Ионные транспортеры дрожжей.
1.9. Функциональное значение ЫаН и КН антипортеров растений
1.9.1. К7Нантнпортсры.
1.9.2. КтаНантипортсры
1.9.2.1. Биохимические свойства.
1.9.2.2. Значение ЫаИантипортеров для растительной клетки.
1.9.2.3. Сравнение структуры и функций ионных транспортеров.
1 Регуляция Ыа7Нантипортеров растений.
. С и терминальные регуляторные домены
. Регуляция экспрессии ЫаНаитипортеров на транскрипционном и посттранскрипционных уровнях.
1 Цели и задачи работы.
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Объект исследования.
2.2. Получение растительного материала.
2.3. Выделение РНК.
2.4. Синтез первой цепи кДНК.
2.5. ПЦР.
2.6. Клонирование
2.7. Выделение плазмидной ДНК
2.8. Получение и очистка полипептида НуИНХ4 для получения поликлональных антител.
2.9. Электрофорез белков в ПЛАТ с БОБ
2 Иммуноблоттинг белков и НуЫНХ
2 Диссоциация сектора V от У0 УАТФазы
2 Выделение плазматических мембран.
2 Выделение вакуолярных мембран
2 Фракционирование мембран ячменя центрифугированием в градиенте плотности сахарозы
2 Измерение АТФ гидролазной активности в мембранных препаратах.
2 Измерение Нтранспортной активности НАТРаз
2 Измерение ионного обмена и пассивной проницаемости везикул для протонов .
2 Реактивы.
2 Статистика.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Характеристика выхода, чистоты, ориентации выделенных везикул плазмалеммы и тоиопласта.
3.2. Измерение Нтранспортной активности 1ГАТФаз плазмалеммы и тоиопласта.
3.3. Измерение пассивной проницаемости везикул для протонов и АТФгидролазнон активности.
3.4. Исследование распределения белков в мембранах тоиопласта.
3.5. Диссоциация У1 сектора УАТФазыи иммунодетекция белков ЗЗС
3.6. Ионный обмен в мембранных везикулах плазмалеммы и тоиопласта
3.7. Кинетика ионного обмена в везикулах плазмалеммы и тоиопласта
3.8. Влияние амилорида на ионный обмен.
3.9. Идентификация предполагаемого КН антипортера в ячмене.
3 Установление внутриклеточной локализации ИлФШХ
3 Вестерн анализ НуЫНХ4 в вакуолярных мембранах, выделенных из разных сортов ячменя
3 Исследование экспрессии НуЫНХ4 в разных сортах ячменя
IV. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Идентификация предполагаемого вакуолярного КНантипортера ячменя НуЫНХ4.
4.2. Функционирование ионных транспортеров плазмалеммы и тоиопласта в проростках ячменя
4.2.1. НАТФазы.
4.2.2. КаНобменная активность в везикулах плазмалеммы и тоиопласта.
4.2.3. КНобменная активность в везикулах тоиопласта
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В последнее десятилетне достигнут определенный прогресс в понимании механизмов поддержания ионного гомеостаза в растительных клетках. Важным критерием устойчивого растения, принято считать высокое соотношение 7 в цитозоле клеток. Важная роль среди большого набора ионных транспортеров и ионных каналов, обеспечивающих это соотношение, принадлежит протонным насосам и 7антипортсрам плазмапеммы и тонопласта. На7Нантииортеры используют ДрН, генерируемый протонными насосами, для удаления из цитоплазмы либо в апопласт, либо в вакуоль i . Ыа7Наитипортеры растений представляют собой мембранные белки, имеющие сходные структуру и функции. Это было установлено в опытах, проведенных в гстерологичной системе дрожжей и в опытах по сверхэкспрсссни Ыа7Нантнпортеров в растениях . Однако каковы особенности работы ионных транспортеров при солевом стрессе в разных по солеустойчивости сортах сельскохозяйственноценных культур еще до конца не иследован. Ранее в нашей лаборатории были охарактеризованы по солеустойчивости и накоплению ионов и К несколько контрастных сортов ячменя, и возник вопрос, существует ли взаимосвязь между полученными данными и функционированием ионных транспортеров. Калий в растительной клетке, как известно, является основным ионным осмотиком и расположен в двух пулах вакуолярном и цитоплазматическом. ЫаС1, функция калия в осмотической адаптации частично переходит ионам натрия. Ионы калия поступают в вакуоль по каналам и транспортерам, в том числе и при работе К7Нантипортеров. Так, в томатах был идентифицирован вакуолярный К7Нантипортер и установлены его функции Уепеша с1 а1. В настоящей работе внимание было уделено идентификации гомолога К7Нантипортера томатов в ячмене и изучение его экспрессии в контрастных по солеустойчивости сортах ячменя при повышенных концентрациях ЫаС1 в среде, а также исследованию особенностей функционирования ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта в разных органах растений ячменя при различной сортовой солеустойчивости. Растения в условиях почвенного засоления подвергаются следующим неблагоприятным факторам эффекту осмотического давления в среде, который возникает в результате относительно высокой концентрации солей и токсическому действию самих солей непосредственно на протоплазму растительных клеток Строганов . Для описания ответов растения на засоление предложена двухфазная модель. В течение начальной фазы, которая продолжается на протяжении нескольких дней, доминирует водный дефицит, в результате чего снижается рост листьев. С началом второй фазы преобладает токсичное влияние самих ионов, что приводит к торможению фотосинтеза вплоть до опадения листьев . В растительных клетках поддержание высоких концентраций К и низких высокого соотношения в цитозоле является одним из ключевых факторов в преодолении солевого стресса . Концентрации токсичных солей в клетке выше физиологического порога снижают стабильность некоторых ферментов, повидимому, за счет нарушения гидрофобных и электростатических взаимодействий, поддерживающих структуру белка . К необходимый активатор для ферментов цитозоля, фотосинтетических ферментов и клеточного метаболизма i . Ионы натрия конкурируют с К и с двухвалентными катионами за связывающие сайты па ферментах, негативно влияя на их активность. Было также установлено, что замещает Са2 на плазматической мембране, вследствие чего меняется мембранная проницаемость и индуцируется утечка К из клеток . Солевой стресс специфично ингибирует РНК процессинг, синтез белка, циклинзависимые протсинкнназы i и ферменты синтеза АБК . Токсичное действие хлора выражается в конкуренции с другими анионами за места связывания на РНК . Одни из эффектов солевого стресса гиперосмотнческий стресс. Он вызывает в клетках дисбаланс ионов, изменение осмотического потенциала, активности и стабильности клеточных ферментов. Рост растительных клеток, главным образом, является результатом растяжения клеток путем увеличения центральной вакуоли. Для роста клеток и механической жесткости клеточных стенок требуется поддержание необходимого тургорного давления, которое падает при солевом стрессе.