Изучение закономерностей эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1

• Автор: Пазилин, Алексей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : 6 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация генома ВИЧ1

1.2. Структурная организация обратной транскриптазы.

1.2. Структурная организация обратной транскриптазы.

1.2.1. Структура фермента

1.2.2. Коиформацноиные изменения в Р при связывании матрнцызатравкн и

1.2.3. дНТФсвязываюший сайт.

1.2.4. Стадии цикле полимеразной реакции.

1.3. Обратная транскрипция

1.4. Эволюция лекарственной устойчивости
1.5. Классификация ингибиторов полимераз
1.6. Нуклеотидные и нуклеозидные интбиторы ОТ.
1.6.1. Механизм резистентности к нуклеозидным ингибиторам
1.6.2. Мутации, ассоциированные с устойчивостью к нуклеозидным и нуклеотидным
ингибиторам.
1.6.3. Паттерны кроссрезистентности.
1.7. Пенуклеозидныс ингибиторы обратной транскриптазы.
1.8. Взаимодействия между мутациями к НИ и НИ.
1.9. Межсубгиповая вариабельность.
1 Третий гипервариабельный домен УЗ 0
11. Структура УЗ.
12. Вирусный тропизм.
13. Проникновение вируса в клетку
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Пациенты.
2.2. Забор крови и выделение лимфоцитов.
2.3. Выделение тотальной ДМК
2.4. Проведение полимеразной цепной реакции.
2.5. Электрофорез ДНК.
2.6. Приготовления ДИК для секвенироваиия
2.7. Секвенирование ДНК
2.8. Построение алайментов и филогенетический анализ.
2.9. Клонирование последовательностей УЗ петли ВИЧ1.
2.9.1. Получение рекомбинантных плазмид.
2.9.2. Приготовление компетентных клеток
2.9.3. Трансформация плазмидной ДНК.
2.9.4. Селекция плазмид, несущих последовательности УЗ петли
2.9.5. Выделение плазмидной ДНК.
2 Анализ вариабельности области ро1
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Ретроспективный анализ популяционной изменчивости области УЗ РостовоЭлистинской когоргы ВИЧиифицированных.
3.1.1. Анализ изменчивости УЗ петли.
3.1.2. Анализ Вэпитоиа УЗпегли в когорте ВИЧнмфнцировапных.
3.2. Анализ изменчивости УЗ петли у отдельных пациентов.
3.3. Анализ консервативного региона генома ВИЧ1.
3.3.1. Анализ вариабельности области ро1 ВИЧ1 и подбор праймеров для амплификации.
3.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов амплификации.
3.3.3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей вариантов вируса О субтипа.
3.3.4. Анализ синонимичных и несинонимичных замен в функциональных доменах ОТ.
3.3.5. Анализ мутаций устойчивости возникающих при терапии азидотимидином.
3.3.6. Анализ мутаций устойчивости к другим нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам ОТ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Благодарности.
Список литературы


Эти замены обеспечивают дальнейшее изменение в верхушке УЗ петли с вРв на АРв. Уровень изменчивости области УЗ у пациентов РосговоЭлистинской вспышки возрастает по мере прогрессии заболевания и длительности персистенции вируса в организме ВИЧинфицированного. Проведен молекулярногенетический анализ фрагмента 7 н. ОТ ВИЧ1 7 образцов гг. РостовоЭлистинской вспышки года. Различия по аминокислотному составу между субтипами в гене ОТ варьируют, в среднем, от 3 до , в зависимости от функционального домена. Различия по нуклеотидной последовательности составляют 8 . Мутации, возникающие при терапии АЗТ у вариантов субтипа О, не отличаются от соответствующих, описанных для субтипа В. Мутации, поддерживающие устойчивость к другим НИ и ННИ у субтипа в, такие же как у суб гипа В. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Организация генома ВИЧ1. Вирус иммунодефицита человека типа 1 является типичным представителем подсемейства лентивирусов семейства ретровирусов и организация его генома в настоящее время хорошо изучена. Длина молекулы вирусной РНК варьирует у разных вариантов ВИЧ1 и в среднем составляет около 9,6 тыс. Анализ нуклеотидной последовательности позволил установить, что геном ВИЧ1 имеет типичную для лентивирусов организацию. Вирусная геномная РНК синтезируется клеточным ферментом РНКполимеразой II, содержит кэпструктуру на своем 5конце, а так же цепочку полиА на 3конце молекулы. На ранних этапах инфицирования вирусная РНК транскрибируется в молекулу двуцепочечной линейной ДНК с двумя длинными концевыми повторами ЬТЯ, фланкирующими уникальную часть генома. Участок ЬТК ретровирусов условно подразделен на три области Ш, И, и5. Последовательность Ш содержит промоторные элементы. Последовательность Я расположена на 5 и 3 концах геномной РНК и выполняет важную роль в процессе переноса синтезируемой цепи с одного конца генома на другой при обратной транскрипции. Последовательность 5 содержит сигналы полиаденилирования вирусных мРК. Процесс обратной транскрипции осуществляется ферментом РНКзависимой ДНКполимеразой, кодируемым вирусом, часто также называемой обратной транскриптазой ОТ. Вновь синтезированная ДНК переносится в ядро клетки хозяина в составе так называемого преинтеграционного комплекса ОеМегЫот, . В ядре происходит встраивание вирусной ДНК в хромосомную ДНК хозяина, при этом основным агентом процесса является другой кодируемый вирусом фермент интеграза Ш. ДНК, являющаяся провирусом внутриклеточная фаза жизненного цикла. ВИЧ1 несет гены, типичные в целом для группы ретровирусов , , v, а так же характерные для ВИЧ гены , v, vi, v, v, . Структурная организация генома вируса представлена на рисунке 1. Область генов первая открытая рамка, начинающаяся с в положении 8 и кончающаяся ТЛА в положении кодирует внутренние белки вириона матриксный белок , р, сердцевинный белок капсида СА, р, нуклеокапсидный белок , р9 и белок рб. Все указанные белки образуются в результате протеолитического расщепления предшественника р i . i . Область и. и б вирусную ДНКнолимеразу, обладающую активностями обратной транскриптазы и рибонуклеазы Н в интегразу эндонуклеазу, обеспечивающую встраивание ДНК вируса в геном клеткихозяина. Как и у других ретровирусов, кодируемые этим геном белки считываются в виде предшественника с молекулярной массой 0 кД . Продуктами вирусного гена v являются вирусные гликопротеины. Они кодируются открытой рамкой считывания с координатами нуклеотидные остатки и. Синтезируемый предшественник после нарезания образует зрелые наружный и трансмембранный гликопротеины, образующих рецепторсвязывающий комплекс . Транскрипционный трансактиватор и регулятор экспрессии v, кодируемые двумя перекрывающимися экзонами, отвечают за экспрессию вирусных генов. Гены vi v, v и , называемые также аксессорными дополнительными, имеют большое значение для репродукции вируса в организме ВИЧ инфицированного. Рисунок 1.