Флуоресцентные белки для экспериментальной биологии: природное разнообразие и направленное изменение спектральных свойств

• Автор: Лукьянов, Константин Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 48 с. : ил.; 20х14 см

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. ШЛ Акадек

Официальные оппоненты

Членкорреслондент РАН, доктор химических нау Кочетков С Л.

профессор

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Доктор биологических наук, профессор Деев С.М.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Доктор биологических наук, профессор Красновский

Институт биохимии им. А. Н. Баха

Ведущая организация

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физикохимичекой биологии им. А. Н. Белозерского
Защита состоится Йноня г. в часов на заседании специализированного совета Д.2.9. при Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу , ГСП7, Москва, В7, ул. МиклухоМаклая, .
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биоорганической химии
им. чхад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
V I1
уферат разослан апреля г.
й секретарь специализированного совета, химических наук
В. А. Несмеянов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность


Часто пигменты присутствуют не в свободной форме, а в виде стехиометрического комплекса с белком. Исключением из этого является семейство подобных белков. Нами была открыта особая группа подобных белков нефлуоресцентные хромобелки ХБ. Первым был обнаружен ХБ 5, определяющий малиновую окраску кончиков щупалец морского анемона i Рис. А. Далее, кДНК новых ХБ, названных , , срСР и , были клонированы из морких анемонов i i, ii i, ii i и твердого коралла i vi. ХБ характеризуются тем, что эффективно логлощают свет, но практически не флуоресцируют Рис. Все известные хромобелки имеют единственный пик поглощения с максимумом от около 0 до 0 нм Рис. Примечательно, что в этой области спектра даже незначительное смещение максимума поглощения приводит к существенному изменению восприятия цвета белка оттенков малинового, сиреневого, фиолетового и синего цвета. У некоторых хромобелков обнаруживается очень слабая красная или дальнекрасная флуоресценция с квантовым выходом менее 0. Для поиска подобных хромобелков с максимумом поглощения в красной области спектра нами была применена новая стратегия широкомасштабного поиска. Многие коразловые полипы имеют окрашенные части тела, окраску которых определяют подобиые белки, среди которых можно было бк найти белки с максимальным красным сдвигом. Однако клонирование соответствующих генов с целыо выяснения их спектральных свойств является очень трудоемкой и дорогостоящей работой. Также, определение спектров поглощенияэмиссии непосредственно на живом коралле требует специального оборудования. Мы заметили, что известные хромобелки с максимумом поглощения при нм проявляют малиновую окраску. В то же время, красители с максимумом поглощения при 0 и более нм представляются синими для человеческого глаза. Мы предложили использовать простой метод визуального отбора коралловых полипов с синей окраской для последующего клонирования синих хромобелков с поглощением около 0 нм. Благодаря простоте методики мы смогли инспектировать большое количество экземпляров и видов коралловых полипов, как в морских аквариумах Москвы, так и в природных биотопах рифа Оспрей в Коралловом море у побережья Австралии, где обитает большое разнообразие видов кораллов. При работе на глубине больше 5 м обнаружилось, что изза эффективного поглощения красного света морской водой окраска многих кораллов выглядит синей, но при извлечении на поверхность оказывается малиновой. Для решения этой проблемы мы использовали освещение ручным фонарем, которое восстанавливало правильное цветовое восприятие. Проведенный нами поиск показал, что синяя окраска кораллов встречается крайне редко. В результате был обнаружен только один вид, обладающей синей окраской конская актиния ii i, обитающая в Черном море и найденная нами в аквариуме Московского Зоопарка. Эта актиния обладала ярко синим ободком, опоясывающим область основания подошвы актинии Рис. Б. Мы клонировали кДНК гена нового подобного нефлуоресцентного белка . Новый синий хромобелок, названный аеСР7, обладат максимумом поглощения при 7 нм, что является самым длинноволновым поглощением, описанным для подобных белков на сегодня. В г была описана интересная мутантная форма красного ФБ 3 коммерческое название , названная Е5, которая со временем изменяет цвет своей флуоресценции i . Этот белок обладал яркой зеленой флуоресценцией на начальных этапах созревания. Затем, по мере созревания белка, возникал пик красной флуоресценции, который постепенно нарастал, в то время как интенсивность зеленой эмиссии падала. Таким образом, отношение интенсивностей зеленой и красной флуоресценции отражало возраст белкового образца. Было показано, что Е5 может быть использован в качестве флуоресцентного таймера, который позволяет непосредственно наблюдать пространственновременную картину активации и выключения работы исследуемого генного промотора. Флуоресцентный таймер является принципиально новым инструментом анализа генной экспрессии. В данной работе мы описали новый природный красный ФБ из . Рис. В, названный 2, который проявляет свойства флуоресцентного таймера.