Изучение роли отдельных рибосомных белков в формировании бактериальной рибосомы

• Автор: Корепанов, Алексей Петрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Исследования роли рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, трансляции и жизнедеятельности клеток ii i.

1. Введение.

2. Морфология бактериальной рибосомы, элонгационный цикл, функциональноважные участки рибосомы.

3. Роль рибосомных белков в функционировании и сборке рибосомных субчастиц . i.

3.1. Формирование малой рибосомной субчастицы . i.

3.2. Участие рибосомных белков в формировании функциональных сайтов

3 рибосомной субчастицы.

3.2.1. Специфическое связывание тРНК в сайте субчастицы.

3.2.2. Связывание тРНК в сайте. Роль белков 9 и .
3.2.3. Роль белка 1 в связывании мРНК.
3.3. Сборка большой рибосомной субчастицы . i.
3.4. Участие рибосомных белков в формировании функциональноважных участков субчастицы.
3.4.1. Пепгидилтрансферазный центр.
3.4.2. ГТФазный центр, роль белков 7 и I 1 в трансляции.
3.4.3. 1выступ субчастицы.
4. Дополнительные функции рибосомных белков.
4.1. Рибосомные белки, регулирующие экспрессию генов.
4.2. Внерибосомные функции рибосомных белков . i.
5. Заключение.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы и приборы.
1.1 Химические реактивы.
1.2 Питательные среды.
1.3 Приборы.
1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды.
2. Методы.
2.1. Методы генной инженерии, молекулярной генетики и микробиологии.
2.1.1. Получение компетентных клеток . i и их трансформация плазмидной ДНК.
2.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток . i.
2.1.3. Полимеразная цепная реакция.
2.1.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.1.5. Клонирование гена белка СТС i ii и гена концевого фрагмента белка 5 i для экспрессии в клетках
. i.
2.1.6. Направленный мутагенез концевого фрагмента белка 5 Т. i.
2.1.7. Экспрессия рекомбинантных генов в клетках Е i.
2.1.8. Нокаут хромосомных генов . i с использованием метода ii.
2.1.9. Клонирование генов i viv с использованием ii.
2.1 Анализ необходимости гена для выживания клеток . i.
2.1 Общая трансдукция бактериофагом Р1.
2.1 Определение времени удвоения клеток . i.
2.1 гатактозидазный тест.
2.2. Биохимические методы.
2.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
2.2.2. Электрофорез РНК в ПААГ в присутствии мочевины и ЭДТА.
2.2.3. Электрофорез РНК и РНКбелковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях.
2.2.4. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН.
2.2.5. Двумерный электрофорез белков в ПААГ.
2.2.6. Выделение белка СТС i ii из клеток суперпродуценгного штамма . i.
2.2.7. Выделение концевого фрагмента белка 5 Т. i и его измененных форм из клеток суперпродуцснтного штамма . i.
2.2.8. Выделение рибосом из . i.
2.2.9. Анализ рибосом . i центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.
2.2 Получение безрибосомного экстракта 0 и тотальной ферментной фракции из клеток . i.
2.2 Трансляция полии и природных мРНК в бесклеточной системе из
. i.
2.2 Ограниченный гидролиз 5 рРНК РНКазой А.
2.2 Выделение 5 рРНК . i и мечение по 5концу.
2.2 Определение константы диссоциации комплекса рРНК методом сорбции на натроцеллюлозных фильтрах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Нокаут генов рибосомных белков платформы рибосомной
субчастицы ii i.
2. Нокаут генов 5 рРНКсвязывающих рибосомных белков . i.
3. Изучение механизма взаимодействия белков семейства СТС с 5 рРНК.
3.1. РНКсвязывающие свойства основного стрессового белка СТС i ii.
3.2. Поиск аминокислотных остатков, ответственных за узнавание 5 рРНК белками семейства СТС.
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Информация о роли рибосомных белков в выживании клеток и в сборке рибосомньтх субчастиц, полученная из этих исследований, была довольно ограниченной. В настоящее время прогресс в молекулярной генетике позволяет осуществлять направленный нокаут хромосомных генов, что существенно облегчает получение дефицитных по рибосомным белкам бактериальных штаммов. Используя современные подходы, можно изучить роль всех рибосомных белков в выживании клеток. А для тех белков, отсутствие которых не является летальным для клетки, можно получить подробную информацию об их влиянии на сборку рибосомных субчастиц и функционирование рибосом. Первая часть диссертационной работы посвящена изучению необходимости рибосомных белков платформы малой рибосомной субчастицы, а также белков 5 рРНКбелкового комплекса для выживания клеток и формирования i viv рибосомы . Для этого мы осуществили нокаут генов рибосомных белков , , 5, и . Нокаут первых четырех генов оказался летальным для клеток Е. Были изучены ростовые характеристики штамма . Кроме того, нами исследовались лишенные белков и 6 рибосомы из жизнеспособных штаммов . Во второй части данной работы изучались особенности взаимодействия рибосомного белка 5 i 5, который гомологичен рибосомному белку . РНК. Рибосомные белки 5 и относятся к семейству СТС, которое получило свое название от основного стрессового белка СТС i ii . Анализ расшифрованных за последние годы геномов показал наличие генов, кодирующих белки этого семейства, в подавляющем большинстве бактерий. Белок продуцируется клетками В. Мы показали, что этот белок способен специфически связываться с тем же участком 5 рРНК, с которым связываются и 5, а также белок, найденный в рибосомной субчастице i i. ТМЪ5. Эти остатки являются строго консервативными в белках СТС. Анализ пространственных структур комплексов ЕсоЬ рРНК, ТМЪ5 рРНК и структуры 8 рибосомной субчастицы В. Ыигат показывает, что эти пять строго консервативных аминокислотных остатков вовлечены в связывание рРК соответствующими белками. Полученные результаты позволяют предположить, что мишенью всех белков семейства СТС как рибосомных, так и шоковых является рРНК. Исследования роли рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, трансляции и жизнедеятельности клеток ii i. Введение. Рибонуклеопротеидная природа рибосом ы породила множество дискуссий о том, какие из е компонентов, белки или II, играют ключевую роль в сборке субчастиц и в их функционировании. В сво время доминировала точка зрения, что рибосомная РНК играет лишь роль каркаса для размещения рибосомных белков, затем появились данные, что РНК сама способна осуществлять энзиматическую функцию. Возникла точка зрения, что именно рибосомная РНК правит бал в процессе трансляции. В настоящее время накоплено множество данных, которые указывают на очевидную необходимость обоих компонентов, белков и РНК для нормального функционирования рибосомы. Представленный обзор литературных данных имеет своей целью собрать воедино биохимические, структурные и генетические данные о роли ряда рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, формировании активных центров рибосомы и выживании бактериальных клеток. В обзор включены данные по рибосомным белкам ii i, так как рибосомы этого организма наиболее подробно изучены с биохимической и генетической точек зрения. Морфология бактериальной рибосомы, элонгационный цикл, функциональноважные участки рибосомы. В ые годы прошлого века применение электронной микроскопии позволило установить, что бактериальные рибосомы представляют собой компактные округлые частицы с линейными размерами около нм 2. При определенных условиях рибосома диссоциирует на две субчастицы с коэффициентами седиментации 8 молекулярная масса 0. Малая 8 рибосомная субчастица имеет продолговатую форму. Ее длина составляет примерно нм, а ширина нм. Рис. Наиболее ярко выражена поперечная борозда, отделяющая головку от тела. Рис. Контуры малой слева и большой справа рибосомных субчастиц . Субчастицы изображены со стороны поверхностей, обращенных друг к другу в рибосоме. Рисунок взят из 2. Большая рибосомная субчасгица имеет во всех направлениях линейные размеры примерно нм. Рис.