Изучение структурно-функциональной организации : β , -субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы Escherichia coli

• Автор: Марков, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение.

1.2. Открытие цинковых пальцев.

1.3. Классификация цинковых пальцев

1.4. Биохимические и генетические подходы к изучению

функций цинковых пачьцев

1.5. Трхмерные структуры цинковых пальцев.

1.6. Моделирование структур цинковых пальцев.

1.7. Роль цинксвязывающих лигандов в формировании

третичной структуры цинковых пальцев

1.8 Взаимодействие цинковых пальцев с ДНК.
1.9. Роль цинковых пальцев в белокбелковых
взаимодействиях.
1 Цинк в ДНКзависимой РНКполимеразе . i
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Бактериальные среды.
2.3. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.4. Ненаправленный мутагенез плазмидной ДНК гидроксиламином i vi.
2.5. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2.6. Клонирование продуктов ПЦР
2.7. Реакция транскрипции тотальной ДНК фага Т
РНКП . i i vi.
2.8. Реакция транскрипции промоторных фрагментов
ДНК РНКполимеразой . i i vi
2.9. Получение тройного элонгационного комплекса РЫКИ . i, остановленного в положении
относительно старта транскрипции.
2 Клонирование гена гроС из термочуствительных
штаммов . i
2 Сайтнаправленный мутагенез клонированного гена
гроС РНКП . i
2 Выделение тел включения гиперпродуцированных
больших субъединиц РНКП . i
2 Выделение и очистка РНКП . i
2 Реконституция РНКП . i i vi совместной
ренату рацией субъединиц.
2 Сборка РНКП . i из независимо
ренатурированных субъединиц
2 Замещение структурносвязанных атомов цинка на
атомы железа в I1КП . i i viv.
2 Аффинное мечение субъединицы 1I в составе фермента с использованием модифицированного
аналога субстрата
2 Реакция гидроксилрадикалыюго расщепления
содсржащей РНКП . i
2 Иммобилизация i агарозе рекомбинантной РНКП, содержащей на Сконце субъединицы
шесть остатков гистидина.
2 Ограниченный протеолиз РНКП трипсином.
2 Расщепление субъединицы, радиоактивно меченой в составе РКП, бромцианом по остаткам
метионина
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Обнаружение мутаций устойчивости к
стрептолидигину в эволюционно консервативном
районе субъединицы РНКполимеразы . i.
3.1.1 vi мутагенез клонированного гена
. i и отбор полученных мутантов
3.1.2. Биохимический анализ устойчивости к
мутантной РНКполимеразы.
3.1.3 Поиск мутаций устойчивости к среди описанных ранее мутаций в гене гроС, влияющих на терминационпыс свойства
мутантных РНКП.
3.1.4 Сравнение транскрипционных свойств
мутантных РНКполимераз, устойчивых к
3.2. Локализация мутаций в гене . i, влияющих на сборку и активность РНКполимеразы при
повышении температуры.
3.3 связывающий сайт в Сконцевом районе 3субъединицы РНКПолимеразы . i участвует в сборке фермента.
3.3.1. Добавление цинка в среду супрессируст фенотип мутаций в гене гроС, влияющих на
сборку РНКполимеразы.
3.3.2. Поиск связывающего домена РНКП методом локального гидрокилрадикального футпринтинга.
3.3.3.Мутагенез Сконцевого связывающсго
3.3.4.Реконституция i vi мутантных РНКполимераз в присутствии 2 и реконституция фермента дикого типа в отсутствии 2 одинаково приводит к
образованию сходного неактивного комплекса.
3.3.5.Только субъединица, рснатурированная в присутствии цинка, способна формировать
активный фермент
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Важность цинка в процессе реализации и переноса генетической информации основана на широком присутствии металла в практически всех известных ДНК и РНКполимеразах, тРНКсинтстазах, элонгационных и транскрипционных факторах, а также других регуляторных факторах эукариот и прокариот V, V , . Тем не менее, как цинк функционирует в упомянутых ферментах и какова природа некаталитических цинксвязываюших сайтов, до сих пор не до конца ясно. В настоящем обзоре речь в основном пойдт об особых элементах третичной структуры в белках, содержащих атомы цинка цинковых пальцах. Одним из основных механизмов регуляции экспрессии генов является прямое взаимодействие регуляторных белков с определенными последовательностями ДНК в составе регулируемых генов. Большинство регуляторных белков имеют для этой цели специальные структурные домены или мотивы, способные непосредственно связываться с ДНК. Один из таких мотивов спиральповоротспирать был впервые открыт и разрешн структурно на примере некоторых бактериальных белковрегуляторов , , , а впоследствии найден в составе гомеодоменов ряда эукариотических транскрипционных факторов i, . ДНКсвязывающис элементы, объединнные лишь наличием в них структурно связанного атома цинка и упорядоченно расположенных остатков цистеина или гистидина. В настоящее время известно уже более 0 дрожжевых белков, содержащих мотив цинкового пальца, и число их стремительно растт. Открытие цинковых пальцев. Цинксодержащие белки были известны науке довольно давно, но прорыв в понимании структурнофункциональной роли атомов цинка в белках произошл в году, когда i, и обнаружили, что первичная структура транскрипционного фактора III из X vi содержит небольшие тандемные повторы, и предположили, что каждый аминокислотный повтор формирует независимый домен вокруг одного атома цинка i . За год до открытия, в году, две независимые группы под руководством . III из X vi необходим для правильной инициации синтеза 5 генов рибосомальной РНК РНКполимеразой III , . Этот белок размером всего кДа связывал определнные пар оснований в районе кодирующей последовательности генов 5 РНК, так называемый элемент внутреннею контроля I. Также III был обнаружен в большом количестве в яичниках неполовозрелых X ввиде 7 рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего, помимо молекулы самого белка III, еш и молекулу 5 РНК продукт регулируемого им гена. При попытках усовершенствовать метод выделения 7 частиц авторы неожиданно обнаружили, что стабильность частиц значительно повышается, если исключить из буферов хелатирующие агенты, такие как ЭДТА и ДТТ. Атомноадсорбционный анализ гомогенного препарата 7 частиц, выделенных без применения хелатируюших агентов, показал присутствие сначала около 9 . Этот результат хорошо коррелировал с данными об относительно высоком содержании в первичной структуре III остатков цистеина и гистидина i , , известных как наиболее типичные лиганды цинка в различных ферментах. РНК i vi . Предварительные эксперименты ограниченному трипсинолизу III показали наличие относительно стабильных продуктов протеолиза массой кДа и кДа. Более глубокая обработка трипсином фрагмента в кДа продемонстрировала, что минимальный размер полипептидного фрагмента, стабильного в более жстких условиях 3 кДа, причм в процессе протеолиза возникал набор промежуточных продуктов, масса которых была также кратна 3 кДа i , , что указывало на существование в нативном белке приблизительно стабильных повторяющихся элементов структуры. Анализ последовательности гена III из библиотеки кДНК i . Рис. Аминокислотная последовательность транскрипционного фактора III из ооцигов X vi i . Последовательность выравнена согласно повторяющимся аминокислотным мотивам, пронумерованным с 1 по 9 в левой части диаграммы. Последовательность консэнсуса повторяющихся мотивов представлена в вверхней части рисунка аминокислоты пронумерованы с 1 по . Звездочки указывают позншш встречающихся естественных инсерций, точки маркируют позиции вариабельных аминокислот. Штрихи показывают разрывы в алайменте.