Гибридизационная цепная реакция и другие способы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в режиме реального времени

• Автор: Чемерис, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы амплификации и высокочувствительной детекции

специфичных фрагментов ДНК и РНК.

1.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени ПЦРРВ

1.3. Лигазная цепная реакция ЛЦР.

1.4. Амплификация смещением цепи i iii

1.5. Амплификация по типу катящегося кольца или рамификация

1.6. Самоподдерживающая репликация

1.7. Технология циклирующей пробы
1.8.Гибридизационная цепная реакция ГЦР
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований
2.2. Выделение и очистка нуклеиновых кислот .77
2.3. Получение кДНК
2.4. Г ибридизационная цепная реакция в реальном времени
2.5. Полимеразная цепная реакция.
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
2.7. Транскрипционная цепная реакция в реальном времени
2.8. Рамификация в реальном времени
2.9. Проведение амплификации по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы в реальном времени
2 Электрофоретический анализ ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот.
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Использованные в работе обычные и модифицированные олигонуклеотиды
2 Основные реактивы, использованные в работе
2 Составы использованных стандартных растворов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени
3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.
3.3. Транскрипционная цепная реакция в реальном времени.
3.4. Рамификация в реальном времени.
3.5. Амплификация по типу катящегося кольца с
дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы.
3.6. Применимость реакций амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени для фундаментальных исследований и диагностических целей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


ДНК с гибридизацией на мембранных фильтрах, на которые ДНК из геля первоначально только агарозного переносилась методом, получившим название блоггинга по Саузерну по фамилии экспериментатора, его разработавшего , . В конце х годов, практически одновременно, четыре исследовательские группы две в Англии, одна в России и еще одна в Югославии предложили различные варианты нового подхода к молекулярной гибридизации, ставившие целью разработать производительное и простое секвенирование ДНК Лысов и др. i, i, . . Серьезной конкуренции этот метод секвенирования другим подходам к этому важному процессу так пока и не составил, однако послужил основой для формирования нового направления ДНКчиповой технологии, которая сейчас очень широко используется, о чем свидетельствует возникновение множества фирм, специализирующихся на изготовлении ДНКчипов. ДГПСчипами разных производителей, в ее основе лежит тот же принцип комплементарности нуклеотидов, и экспериментаторам предлагается выбрать наиболее подходящий для их задач тип ДНКчипа. Важным моментом в гибридизации нуклеиновых кислот всегда являлось мечение гибридизационных проб. На протяжении первых десятилетий главным типом метки была радиоактивная, и преимущественно использовался радиоактивный фосфор. Для гибридизации i i более подходил тритий. Довольно небольшой период пришелся на использование гибридизационных зондов, меченных 5I . . В дальнейшем спектр использовавшихся для мечения меток был заметно расширен . Были предложены такие способы, как мечение биотином . , , , разработаны хемилюминесцентные i . , i, и флуоресцентные пробы, в том числе с эффектом . Вышеупомянутые методы молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот характеризовались каждый своей чувствительностью, позволяя с помощью той же блотгибридизации по Саузерну работать с генами, представленными в геноме единичными копиями, но не с представленными в реакционной смеси единичными молекулами ДНК. С появлением метода полимеразной цепной реакции ii . ПЦР. Причем некоторый бум вокруг всего этого пришелся на самый конец х и начало х гг. Табл. В результате сформировалось как бы две группы методов, часть из которых будет рассмотрена нами в других разделах литературного обзора более подробно. К одной из них можно отнести методы, направленные на увеличение числа копий фрагмента ДНК или РНК, выступающего в качестве мишени, а к другой методы, разными способами обеспечивающие повышенную чувствительность реакции молекулярной гибридизации. Так, в вышеозначенный период из первой группы появилась лигазная цепная реакция , , , , самоподцерживающаяся репликация . i . , , репликазная амплификация i . . Позднее амплификация смещением цепи получила заметное развитие, дав начало ряду вариаций в виде амплификации по типу катящегося кольца с одним праймером или с двумя, превратив се тем самым в рамификацию ii . . i i iii амплификации i . 2 или амплификации двумя кольцами . Принцип смещения старой цепи ДНК работает и в методе, названном японскими авторами I I ii iiii iii i i ii . i . i . На смещении цепей ДНК построен и метод изотермической линейной амплификации i, в котором также используется гибридный рибодезоксирибоолигонуклеотидный праймер . Что касается ПЦР, если не считать перевода этой реакции в режим реального времени, то она практически за эти годы не изменилась принципиально. Однако недавно была разработана так называемая i iii, или холодная ПЦР, где стадия высокотемпературной денатурации отсутствует, а ее роль выполняет фермент геликаза, расплетающая цепи ДНК Vi . .