p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53

• Автор: Разорёнова, Ольга Валериевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

У Введение

г 1.1 Онкогены и опухолевые супрессоры

1.2 р центральный компонент сигнальных путей,

1.2.1 ограничивающих злокачественный рост клеток Последствия инактивации генар

1.2.2 Биологическая роль гена р

1.2.3 Функции, строение молекулы и активация белка р

1.2.4 Транскрипционные мишени белка р

1.2.5 Латентное и активированное состояние белка р

1.2.6 Активации р в ответ на стрессы

1.3 Белки, физически взаимодействующие с белком р и
1 модулирующие его функции
1.3.1 ШГ1зависиммй сигнальный путь
1.3.1.1 Структура белка Н1К1 главного регулятора кислородного
1.3.1.2 гомеостаза Огзависимаи регуляция активности ШЕ1и
1.3.1.3 Транскрипционные мишени Н1Е
1.3.1.4 Роль р в ответе клетки на действие гипоксии
1.3.1.5 Роль р в регуляции активности Н1Е
V 1.3.2 8Езависнмый сигнальный путь и белки теплового шока
1 1.3.2.1 Регуляция экспрессии НЭР
V 4 1.3.2.2 Локализация ПБР
1.3.2.3 Экспрессия НЯР в раковых клетках
1.3.2.4 НБР и р
1.3.2.5 Возможные механизмы стабилизации белка р
1.3.2.6 Стабилизация мутр за счет ассоциации с Н8Р
1.3.2.7 Стабилизация мутр за счет ассоциации с Н8Р
1.3.2.8 Взаимодействие р с морталинамн
1.4 Рспортсрныс конструкции для изучения динамики активности
. 1.4.1 белков различных сигнальных путей Технология рспортерных генов
1.4.2 Репортерныс гены
1.4.3 Применение репортерной технологии
1.4.3.1 Введение экзогенного генетического материала в клетки и
1.4.3.1.1 экспрессии генов Анализ промоторов
.2 Мониторинг эффективное трансфекции досгавки
1 трансгенов внутрь клеток Визуализация генной экспрессии
1.4.3.2 Биологические скрининги и открытие химических соединений
.1 Характеристика рецепторов и их лигандов
0. 1.4.3.2.2 Изучение сигнальных путей
1.4.3. Применение репортерной технологии в токсикологии
П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
.1 Клеточные линии и их культивирование
.2 Обработки клеточных линий химическими соединениями и
тепловым шоком
.3 Векторы и плазмидные конструкции
3.1 Iчувствительные репортерные плазмиды
.3.2 4iiii репортерные плазмиды
И.3.3 рчувствтелы1ыс репортерные плазмиды
П.3.4 Плазмиды, экспрессирующие i
.5 Получение конструкций, экспрессирующих р с
последовательностью аминокислот на С или конце
.4 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой, щелочной фосфатазой и ферментом Кленова
.5 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей
.6 Лигирование фрагментов ДНК
.7 Получение компетентных клеток .i и трансформация
.8 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК
.9 Получение ретровирусных и лентивирусных вирионов, заражение ими клетокмишеней и отбор инфицированных клеток на антибиотике
. Окраска клеток на ргалактозндазу
1 X окрашивание
2 окрашивание
. Вестернанализ
. Иммунопрсцинитации
. Выделение идерных и цитоплазматических экстрактов
. Иммунофлуоресценцин
. Коиммунофлуорссцснцня
. Определение субклеточной локализации белка
. Норзернанализ
. ОТПЦРанализ и секвснированис кДНК р
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
II 1.1 Вирусные системы экспрессии генов в культивируемых
клетках млекопитающих
1.2 Получение и оптимизация работы ретролентивирусиых
репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белка р
ШЗ Получение и оптимизация работы ретролентивирусиых
ренортерных конструкций для оценки транскрипционной активносги белков I1 и
1.4 Определение субклеточной локализации и уровня экспрессии белка р в различных опухолевых линиях клеток
1.5 Выяснение природы гранулярного цитоплазматического
окрашивании антителами 1 в некоторых мсланомных клеточных линиях
1.6 Измерение транскрипционной активности белка р в различных клеточных линиях в ответ на обработку клеток рядом химических соединений
1.7 Определение степени рзависимости действия камптотецина на экспрессию геновмишеней белка р
IV. ВЫВОДЫ
V. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Онкогены это клеточные или вирусные привнесенные вирусом в клетку гены, экспрессия которых может привести к развитию опухолевого новообразования. Протоонкогены это нормальные клеточные гены, усиление или модификация функции которых превращает их в онкогены. Опухолевые супрессоры антионкогены, рецессивные опухолевые гены клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность возникновения новообразований, а восстановление функции, наоборот, может подавить рост опухолевых клеток. Следует заметить, что причисляемые к опухолевым супрессорам так называемые мугаторные гены, т. Однако их инактивация столь сильно увеличивает вероятность появления различных онкогенных мутаций, что образование опухоли становится лишь делом времени. Принадлежность к онкогенам или опухолевым супрессорам определяется несколькими критериями а закономерным характером изменений структуры иили экспрессии данного гена в клетках определенных или различных новообразований б возникновением в юном или молодом возрасте определенных форм опухолей у индивидов с передающимися по наследству мутациями данного гена в резким повышением частоты появления опухолей у трансгенных животных, либо экспрессирующих активированную форму данного гена в случае онкогенов, либо несущих инактивирующие мутации данного гена в случае опухолевых супрессоров г способностью вызывать в культивируемых i vi клетках морфологическую трансформацию иили неограниченный рост онкогены, либо подавление клеточного роста иили выраженности признаков трансформации опухолевые супрессоры. Два последних десятилетия характеризовались бурным открытием новых онкогенов и опухолевых супрессоров. К настоящему времени известно около сотни потенциальных онкогенов клеточных и вирусных и около двух десятков опухолевых супрессоров. Были описаны генетические события, приводящие к активации протоонкогенов или инактивации опухолевых супрессоров . Выявлены характерные для тех или иных форм новообразований человека изменения онкогенов и опухолевых супрессоров, в том числе высокоспецифичные аномалии, используемые для постановки диагноза. Однако долгое время знания о каждом из онкогенов или опухолевых супрессоров представлялись дискретными, в значительной мерс не связанными между собой. И лишь в самые последние годы стала вырисовываться общая картина, показывающая, что подавляющее большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами нескольких общих сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома, морфогенетические реакции и дифференцировку клеток. Очевидно, изменения именно в этих сигнальных путях, в конце концов, и приводят к развитию злокачественных новообразований. Последствия инактивации гена р Функция р не является строго необходимой для нормального развития и функционирования организма полное выключение экспрессии гена р с помощью технологии генного нокаута приводит к рождению жизнеспособных мышей. Однако такие мыши редко доживают до шестимесячного возраста, поскольку у них развиваются злокачественные опухоли 7. Культивируемые клетки р мышей отличаются чрезвычайной геномной нестабильностью и демонстрируют значительные изменения кариотипа уже в первые дни пассирования i vi 8. Повреждения гена р играют центральную роль и в канцерогенезе человека. Точечные мутации и делеции р наблюдаются приблизительно в случаев злокачественных заболеваний, хотя частоты повреждений варьируют в зависимости от тканепринадлежности опухоли 9. В опухолях человека и экспериментальных животных наблюдается также множество других способов инактивации белка р, которые происходят без нарушения структуры его гена. В этих случаях происходят нарушения генов, вовлеченных в регуляцию активности р. В таких клетках белок р либо не способен стабилизироваться и активироваться в ответ на разнообразные стрессы, либо напротив его уровень повышен, но это не приводит к дальнейшему запуску характерных внутриклеточных процессов. В результате, как и в клетках с прямыми нарушениями гена рл в той или иной степени, происходит потеря контроля над поддержанием стабильности генома.