Количественное изучение взаимодействия полиуридиловой кислоты с рибосомами Escherichia coli и роль Y-основания в кодон-антикодоновом взаимодействии

• Автор: Катунин, Владимир Иванович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 179 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений .

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Взаимодействие матричной РНК с рибосомами .

1.1.1. Введение

1.1.2. Условия комплексообразования и стабильность комплексов

1.1.3. Взаимодействие мРНК с Б РНК.

1.1.4. Роль белка в процессе взаимодействия мРНК с рибосомой .

1.1.5. Взаимодействие мРНК с рибосомными белками .

1.1.6. Количественное изучение взаимодействия синтетических и естественных матриц с рибосомами .
1.1.7. Выводы
1.2. Роль гипермодифицированных оснований, расположенных с Зстороны антикодона тРНК, в процессе биосинтеза белка
1.2.1. Введение
1.2.2. Роль гипермодифицированных оснований в аминоацилировании и во взаимодействии с ЕРТи фактором .
1.2.3. Влияние модификации 3соседнего основания антикодона на взаимодействие комплементарных олигонуклеотидов с антикодоном тРНК
1.2.4. Влияние модификации 3соседнего антикодону основания на взаимодействие тРНК с комплементар
Стр.
ными антикодонами .
1.2.5. Влияние гипермодифицированного основания на
взаимодействие тРНК с рибосомами
1.2.6. Неспособность модифицированных оснований образовывать пары КрикаУотсона
1.2.7. Модифицированные основания участвуют в связыва
нии иона магния, расположенного в антикодоновой петле тРНК.
1.2.8. Выводы .
1.3. Заключение. Задачи данного исследования .
Глава П. ЭКСПЕРШШТАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ
2.1. Выращивание клеток для выделения рибосом и тРНК
2.2. Выделение рибосомальных субчастиц .
2.2.1. Выделение неочищенных рибосом .
2.2.2. Выделение рибосомальных и субчастиц
2.3. Выделение фракции суммарных аминоацилтРНК син
тетаз .
2.3.1. Выделение фракции суммарных аминоацилтРНК син
тетаз из .i .
2.3.2. Выделение фракции суммарных аминоацилтРНК син
тетаз из дрожжей
2.4. Выделение транспортной РНК
2.4.1. Выделение немеченной тРНК
2.5. Препаративное аминоацилирование тРНК.
2.5.1. Препаративное аминоацилирование тРНК из .i
2.5.2. Препаративное аминоацилирование тРНК из дрожжей
2.6. Обогащение фенилаланилтРНК из Е.со I
2.7. Обогащение фенилаланилтРНК из дрожжей
Стр.
2.8. Обогащение фенилаланилтРНК из дрожжей, лишенной основания.
2.9. Химический синтез ацетил тРНК
2 Выделение фракции полии со средней молекулярной массой ООО дальтон
2 Выделение фракционированной II полии
2 Выделение рибосомного белка 1 и субчас
тщ, обедненных по этому белку .
2 Связывание 3Н полии с субчастицами
и рибосомами .
2 Измерение связывания тРНК с рибосомами .
Глава Ш. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИУРИДИЛОВОЙ КИСЛОТЫ С СУБЧАСТИЦАМИ И РИБОСОМАМИ ii i
3.1. Цель исследования.
3.2. Причины гетерогенности комплекса субчас
тица. поли .
3.3. Измерение изотермы адсорбции Н полии с
белком I
3.4. Влияние внешних условий на стабильность комплекса субчастица полии
3.5. Связывание 3Нполи с рибосомами
3.6. Влияние канамицина на взаимодействие Н по
ли с рибосомами
3.7. Обсуждение результатов .
3.8. Выводы . НО
Стр.
Глава У. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ АМИНОАЦИЛИ ПЕПТЩЩтРНК С Р САЙТОМ РИБОСОМ ii со
4.1. Цель исследования
4.2. Взаимодействие тРНК с,. и ацетил
тРНК . с Р сайтом рибосом ИЗ
4.2.1. Дискриминация связывания аминоацилтРНК и пептвдилтРНК с А и Р сайтами рибосом
4.2.2. Измерение констант ассоциации и ацетил тРНК с Р сайтом рибосом
4.3. Связывание тРНК у и ацетил
тРНКу с рибосомами .i .
4.3.1. Взаимодействие тРНК Ру с субчастицами
4.3.2. Дискриминация связывания РЬетРНКув и ацетил тРНК Ру с А и Р сайтами рибосом
4.3.3. Измерение констант ассоциации тРНКу и
ацетил тРНК у с Р сайтом рибосом
4.4. Обсуждение результатов
4.5. Выводы.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поскольку в задачи данной работы входит количественное изучение взаимодействия полии с субчастицами и рибосомами . РНК рибосома и факторах, влияющих на стабильность этих комплексов. I.I. Условия комплексообразования и стабильность комплексов. Рибосомы i i связывают естественные мРНК и многие синтетические полинуклеотиды при концентрации ионов магния СГ3 М и выше . Когда рибосомы представлены в молярном избытке над полинуклеотидом, то образуются полирибосомы, то есть к одному полинуклеотиду оказывается прикреплено несколько рибосом. Участок для связывания мРНК расположен на субчастице, поскольку, отдельно взятая, она способна взаимодействовать с мРНК, в отличие от субчастицы 8. Вторичная структура мРНК препятствует связыванию последней с рибосомами. Так, полинуклеотиды, обладающие ярко выраженной вторичной структурой полигТ , полиА, поли , рибосомальная РНК,весьма слабо или вообще не связываются с рибосомами, в отличие от хорошо связывающихся полинуклеотидов со слабой вторичной структурой полии, полиС, поли ис 8,. Однако, когда вторичная структура разрушается обработкой формальдегидом, они оказываются способны взаимодействовать с рибосомами 8. С другой стороны, мРНК фага Т4 , вирусные РНК и многие другие естественные матрицы, обладающие некоторой вторичной структурой, также связываются с рибосомами в отсутствие факторов инициации. Связанная мРНК легко обменивается на экзогенную свобод
ную матрицу. Конкуренцию за один и тот не сайт на рибосоме наблюдали между полии и поли С , полии и мРНК фага , полии и РНК вируса нелтой мозаики тернепса . Об обратимости взаимодействия мРНК с рибосомой говорит и то, что она диссоциирует из комплекса в процессе седиментации через градиент сахарозы . М и выше. Однако, ионы Мд в инкубационной среде
могут быть заменены на ионы Са или Мп в той не концент
рации 0 М или на спермин с концентрацией на порядок мень
ше 0 М 7. В то же время увеличение концентрации ионов К1 приводит к дестабилизации комплекса . Присутствие тРНК повышает сродство мРНК к рибосомам. Хатфилд показал, что тРНК и олигонуклеотиды взаимно стимулируют друг друга в связывании с рибосомой, а Маклафин и др. РНК усиливает обычно слабое связывание полий с рибосомой. Повцдимому, стабильность комплекса мРНК рибосома зависит и от размеров мРНК. Сведения о размерах участка полинуклеотвдной цепи, защищаемого рибосомой от гидролиза различными нуклеазами, довольно противоречивы. По данным Талонами и Зубея для полии его длина, составляет нуклеотидов, а по данным Кастлеса и Зингера нуклеотида при средней длине полии
нуклеотвдов и при длине полии в 0 нуклеотидов. Для естественной матрицы величина участка, защищаемого от гидролиза нуклеазой, составляет нуклеотидов . I.I. Взаимодействие мЕНК с РНК. Сравнивая последовательности 3концов рибосомальной РНК нескольких видов бактерий с последовательностями нуклеотидов, предшествующими кодону инициации в нетранслируемых участках фаговых мЕНК, Шайн и Далгарно заметили, что довольно протяженные нуклеотидные последовательности в этих районах комплементарны друг другу. Опираясь на эти факты, они предположили, что 3концевой додекануклеотид рибосомальной РНК прямо участвует в селекции инициаторных сайтов мРНК, образуя несколько УотсонКриковских пар с богатой пуринами последовательностью, расположенной с 5стороны от инициаторного триплета в мРНК . Мина комплементарного района в различных мРНК варьируется от 3 до 9 нуклеотцдов, в среднем образуется комплементарных пар. В настоящее время накопилось большое количество прямых экспериментальных доказательств участия последовательности ШайнДалгарно в процессе инициации. Так было установлено, что механизм действия ингибитора инициации колицина. ЕЗ заключается в отщеплении пятвдесятинуклеотвдного фрагмента с 3конца РНК . Позднее Стайц и Джейкс прямо обнаружили гибрид мРНКрРНК в числе продуктов рибонуклеазного гидролиза инициаторного комплекса. Этот гибрид содержал примерно эквимолярные количества тридцатинуклеотидного участка из инициаторной области цистрона белка А бактериофага и пятидесятинуклеотидного концевого фрагмента рРНК. Кроме того.