Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ

• Автор: Рязанцева, Анастасия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

Содержание

I. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные задачи исследования.

1.4. Научная новизна работы.

1.5. Научнопрактическая ценность.

1.6. Основные положения, выносимые на защиту.

1.7. Апробация работы.

II. Обзор литературы.

2.1. Общие сведения о вирусе гепатита С ВГС.

2.2. Структура и организация генома. Краткая характеристика некоторых продуктов его экспрессии
5 нетранслируемый участок
3 нетранслируемый участок З
вирусные протеины. Структурные белки. Белок
гликопротеины оболочки
неструктурные 6.

2.3. Тканевой тропизм ВГС.
2.4. Роль ВГС в канцерогенезе.
2.5. Метод ОТПЦР i i.
2.6. Морфогенез ВГС.
III. Материалы и методы.
3.1. Клинический материал для детекции РНК ВГС.
3.2. Метод ПЦР.
З.З.ОТПЦР i i.
3.4. Электронная микроскопия.
IV. Результаты и обсуждение.
4.1. Метод ОТПЦР i i.
4.2. Обнаружение РНК ВГС i i.
4.3. Локализация i i.
4.4.Ультраструктурные исследования.
4.5. Общее заключение по обсуждению.
V. Выводы.
VI. Слисок цитируемой литературы.
Глава I.
Введение


Вирус гепатита С ВГС, как предполагается, проник в человеческую популяцию довольно давно и в настоящее время получил широкое распространение, в том числе изза парентеральных манипуляций. Число инфицированных вирусом около 0 млн. У заболевших острым гепатитом С развивается хроническая персистирующая ВГСинфекция, при которой вирус сохраняется и размножается в организме в течение десятков лет 5. Данные о частоте встречаемости гепатита С неоднородны и колеблются от 0,1 от общей численности населения в таких странах, как Исландия, или Норвегия и до ,1 в Египте . Кроме того, на фоне хронического вирусного гепатита может развиваться первичный рак печени гепагоцеллюлярная карцинома. Как известно, гепатоцеллюлярная карцинома является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека. Среди злокачественных новообразований печени на е долю приходится , а ВГС, наряду с ВГВ вирусом гепатита В, являются важнейшими этиологическими агентами. Причем в некоторых регионах . Японии, доля ВГСинфекции в этом отношении является ведущей, достигая . Несмотря на вс вышеперечисленное, до сих пор остаются неизученными молекулярнобиологические аспекты репродукции вируса. Также однозначно не выяснена его внутриклеточная локализация. Хотя факт участия ВГС в развитии гепатоцеллюлярной карциномы доказан, молекулярные механизмы ВГСассоциированного канцерогенеза не изучены до настоящего времени. РНК вируса непосредственно в инфицированной ткани i i. РНК. Таким методом, по сути, является гибридизация i i. Однако, этот метод в применении к вирусу гепатита С имеет низкую чувствительность и дает не очень достоверные результаты изза того, что вопервых, количество вирионов ВГС в ткани невелико, а вовторых, в процессе выполнения процедур его РНК часто подвергается разрушению. Метод ОТПДР i i был разработан на основе двух методов метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации i i. Однако, несмотря на преимущества, ОТПЦР i i обладает и некоторым недостатком. Более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады, имеющие место на этапе амплификации, приводят к более сильному, чем при гибридизации i i, разрушению срезов. Также к сложностям ОТПЦР i i можно отнести его многоэтапность, трудомкость и высокую стоимость реактивов. Вс это вместе и привело к тому, что в нашей стране этот метод практически не применяется, в то время как за рубежом появляются исследования с применением ОТПЦР i i для идентификации различных вирусов. О первых результатах, полученных с использованием этого метода сообщалось в работе А. Т . В дальнейшем, количество работ с применением метода обнаружения РНК ВГС в срезах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин заметно возросло, но наибольший вклад в развитие и стандартизацию методики, ее усовершенствование и изучение с ее помощью ВГС внес . Применение метода детекции РНК ВГС i i позволило обнаружить ВГС не только в гепатоцитах, но и в купферовских клетках 6. Кроме того, было показано, что РНК вируса гепатита С обнаруживается не только в печени, но и, например, в лимфоцитах , и в эритротроцитах . До сих пор остатся спорным вопрос о внутриклеточной локализации РНК ВГС. Некоторые исследователи сообщают о нахождении РНК ВГС только в цитоплазме гепатоцитов , , 3, 4, другие указывают на исключительно ядерную локализацию 7, третьи обнаруживают РНК ВГС как в цитоплазме, так и в ядрах клеток 6, , , , , 8. Цели и задачи исследования. Цель данной работы модификация метода ОТПЦР i i для рутинного гистологического материала, выявление РНК ВГС в клетках печени больных с хроническим гепатитом Сиу больных с диагнозом гепатоцеллюлярный рак на биопсийном и операционном материале, также изучение тропизма вируса гепатита С в клетках и ткани печени методом ОТПЦР i i. Основные задачи исследования. Модификация и оптимизация и использование морфологического метода ОТПЦР i i для исследования РНК ВГС на парафиновых срезах. Детекция и внутриклеточная локализация геномной РНК ВГС у больных с хроническим гепатитом С ХГС.