Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах

• Автор: Коммер, Айгар Акселович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Первые бесклеточные системы трансляции

1.1.1. Открытие синтеза белка в клеточных экстрактах.

1.1.2. Трансляция экзогенных матриц

1.2. Прокариотические и эукариотические типы бесклеточных систем экспрессии

1.2.1. Экстракт . i

1.2.2. Экстракт зародышей пшеницы

1.2.3. Лизат ретикулоцитов кролика .

1.3. Форматы бесклеточных систем.

1.3.1. формат

1.3.2. Длительно работающие системы

1.3.3. Бесклеточные системы непрерывного потока .
1.3.4. Бесклеточные системы с непрерывным обменом
1.3.5. Чистая система Уэда.
1.3.6. Искусственная клетка
1.4. Матрицы для бесклеточных систем.
1.4.1. Структура прокариотической матрицы
1.4.2. Трансляция безлидерных мРНК.
1.4.3. Кодоновый контекст
1.4.4. Редкие кодоны.
1.4.5. Использование сигнальных пептидов.
1.4.6. Стабилизация матриц.
1.4.7. Одновременная экспрессия разных генов.
1.5. Экстракты . i.
1.5.1. Генетика
1.5.2. Выращивание клеток для приготовления бесклеточных экстрактов
1.5.3. Приготовление экстракта.
1.6. Увеличение продуктивности бесклеточных систем.
1.6.1. 2 и фосфат.
1.6.2. Другие соли.
1.6.3. Нуклеотиды
1.6.4. Аминокислоты
1.6.5. Стабилизирующие компоненты
1.6.6. Другие факторы
1.6.7. Обеспечение системы энергией
1.6.8. Соотношение объма реакционной смеси и е поверхности.
1.7. Применение бесклеточных систем
1.7.1. Включение неприродых аминокислот
1.7.2. Применение бесклеточного синтеза для решения структуры белка
1.7.3. Синтез антибактериальных пептидов.
1.7.4. Синтез мембранных белков
1.7.5. Другие примеры использования бесклеточных систем
1.8. Сворачивание белка
1.8.1. Влияние температуры на сворачивание белка.
1.8.2. Влияние лигандов на сворачивание белка
1.8.3. Синтез белков с диульфидными мостиками
1.8.4. Влияние молекулярных шаперонов на сворачивание синтезируемого белка.
1.8.5. Влияние детергентов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Котрансляционное связывание гема полипептидными цепями аглобина, синтезируемыми в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика
2.2. Котрансляционное связывание гема цепями аглобина, синтезируемыми в отсутствие свободных молекул гемоглобина
2.3. Связывание гема незавершенными растущими цепями аглобина
2.4. Связывание гема на рибосомах с короткими растущими цепями аглобина
2.5. Зависимость связывания гема от длины незавершенных растущих цепей аглобина.
2.6. Формирование структуры гемсвязывающего центра глобина.
2.7. Препаративный синтез проинсулина человека в бесклеточной системе.
2.8. Синтез проинсулина человека в присутствии детергентов
2.9. Определение активности проинсулина по активации рецептора инсулина.
МАТЕРИАЛЫ.
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Получение мРНК аглобина.
3.2. Получение меченого гемина
3.3. Расщепление мРНК аглобина рибонуклеазой Н.
3.4. Получение мРНК а, гомогенной по Зконцевой последовательности.
3.5. Трансляция в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика.
3.6. Бесклеточный синтез белка в экстракте из зародышей пшеницы.
3.7. Центрифугирование в градиенте сахарозы.
3.8. Оптимизация условий бесклеточного синтеза проинсулина
3.9. Синтез проинсулина в препаративном масштабе
3 Анализ формирования дисульфидных связей в проинсулине.
. Приготовление хелирующей сефарозы
. Очистка проинсулина, содержащего гексагистидиновый тракт, с помощью металлхелатной хроматографии
. Гидролиз синтезированного проинсулина протеазой У8.
3 Препаративный синтез проинсулина без гистидинового тракта.
3 Протеолиз синтезированного проинсулина для получения инсулина.
3 Определение активности инсулина по способности активировать рецептор
3 Электрофорез белков в полиакриламидном геле.
. Анализ белков с молекулярной массой более б кДа
. Анализ А и В цепей инсулина
. Электрофорез ДНК в агарозном геле
. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ


СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ. Открытие синтеза белка в клеточных экстрактах. Экстракт . Лизат ретикулоцитов кролика . Форматы бесклеточных систем. Бесклеточные системы непрерывного потока . Чистая система Уэда. Матрицы для бесклеточных систем. Трансляция безлидерных мРНК. Редкие кодоны. Использование сигнальных пептидов. Стабилизация матриц. Одновременная экспрессия разных генов. Экстракты . Приготовление экстракта. Увеличение продуктивности бесклеточных систем. Другие соли. Соотношение объма реакционной смеси и е поверхности. Синтез антибактериальных пептидов. Влияние температуры на сворачивание белка. Влияние молекулярных шаперонов на сворачивание синтезируемого белка. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Зависимость связывания гема от длины незавершенных растущих цепей аглобина. Формирование структуры гемсвязывающего центра глобина. Препаративный синтез проинсулина человека в бесклеточной системе. Определение активности проинсулина по активации рецептора инсулина. МАТЕРИАЛЫ. Получение мРНК аглобина. Расщепление мРНК аглобина рибонуклеазой Н. Получение мРНК а, гомогенной по Зконцевой последовательности. Трансляция в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. Бесклеточный синтез белка в экстракте из зародышей пшеницы. Центрифугирование в градиенте сахарозы. Оптимизация условий бесклеточного синтеза проинсулина
3. Анализ формирования дисульфидных связей в проинсулине. Гидролиз синтезированного проинсулина протеазой У8. Препаративный синтез проинсулина без гистидинового тракта. Протеолиз синтезированного проинсулина для получения инсулина. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле. Приобретение белком уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Сворачивание белка остатся самым непонятным в настоящее время этапом в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку. Механизм этого процесса и управляющие им законы не выяснены, несмотря на разнообразные экспериментальные и теоретические подходы, применяемые для его изучения и моделирования. Пристальный интерес к этой проблеме вызван не только е фундаментальной значимостью, но и важностью понимания механизмов сворачивания для медицины и биотехнологии. Сейчас известно, что многие наследственные заболевания связаны с мутациями, нарушающими сворачивание какоголибо белка. В частности, с нарушением сворачивания коллагена связаны многие болезни соединительной ткани . К болезням, вызванным неправильным сворачиванием белков, относят также так называемые прионовые заболевания . Очевидна также важность знания закономерностей сворачивания белков для белковой инженерии и биотехнологии. Известно, что сверхпродукция целевых белков в клеткахп роду центах часто увеличивает уровень ошибок сворачивания, что приводит к образованию телец включения. Это является серьзным ограничением в получении больших количеств биологически активных рекомбинантных белков в условиях их суперпродукции. Наиболее актуальны в решении проблемы сворачивания экспериментальные работы, в которых сворачивание белков исследуется в условиях максимального приближения к природной ситуации, к сворачиванию синтезированных v белков в клетках и бесклеточных экстрактах. Настоящая работа направлена на изучение сворачивания синтезированного v белка и определению этапа биосинтеза, на котором синтезируемая полипептидная цепь приобретает пространственную структуру нативного биологически активного белка. Подходы к исследованию сворачивания белка разнообразны и многочисленны. Однако подавляющее большинство этих исследований относится к сворачиванию полноразмерных полипептидных цепей в нативную структуру, когда в качестве исходного состояния цепи выступает полностью или частично денатурированный белок.