Изучение взаимодействия регуляторных факторов с РНК-полимеразой Escherichia coli

• Автор: Нечаев, Сергей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с.

Оглавление

Актуальность темы

1. Обзор литературы.

1.1. Введение

1.2 Основные принципы регуляции транскрипции.

1.3. Роль нуклеотидной последовательности промотора.

1.4. Теоретическое предсказание промоторов

1.5. Бесфакторная активация транскрипции

1.6. Влияние конформации ДНК на силу промотора

1.6.1 Взаимовлияние промоторов

1.7. Регуляция транскрипции небелковыми эффекторами.

1.8. Регуляция транскрипции рибосомальных РЖ
1.9. Регуляция транскрипции с помощью ковалентной модификаци и Киолимеразы
1 Регуляция транскрипции на уровне взаимодействия
сигма факторов с корферментом IIиолимеразы
1 Регуляция альтернативных сигма факторов.
Регуляция количества о
1 Регуляция других альтернативных сигма факторов
1 Механизм замещения основного сигма фактора
11. Поиск антисигмы основного сигма фактора.
1 Регуляция транскрипции белковыми регуляторами.
1. Репрессоры транскрипции
11. Пассивная репрессия.
12. Сайленсинг
1 Активная репрессия
1 Дополнительные операторы
1 Активация транскрипции
1 Концепции работы активаторов
2. Материалы и мегоды.
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги
2.2. Бактериальные среды
2.3. Синтетические пептиды
2.4. Электрофорез
2.5. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.6. Приготовление ДНК.
2.7. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2.8. Клонирование
2.9. Разделение мутаций 2.
2 Направленный ПЦРмутагенсз.
2 Экспрессия субъединиц РНКполимеразы.
2 Выделение тел включения гиперпродуцированиых субъединиц РНКполимеразы . i
2 Выделение альфа субъединицы РНКполимеразы.
2 Выделение 2 и его производных
2 Выделение сигма субъединицы РНКполимеразы.
2 Сборка РНКполимеразы . i из отдельных
субъединиц i vi
2 Приготовление РНКполимеразы из клеток.
2 Транскрипция i vi
2 Аффинная хроматография на i агарозе.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Изучение молекулярного механизма ингибирования
РНКполимеразы . i продуктом гена 2
3.1.1. Локализация мутаций устойчивости к
на субъединице РНКполимеразы . i
3.1.2. Район И субъединицы место связывания
2 на РНКполимеразе
3.1.3. 2 подавляет формирование открытых промоторных комплексов.
3.1.4. 2 не влияет на взаимодействие РНКполимеразы
с элементом промотора
3.1.5. Взаимодействие консервативного района 4.2 фактора о с элементом промотора является наиболее вероятной мишенью 2
3.1.6. Распространенность функции 2 среди бактериофагов
3.1.7. Ингибирование транскрипции белком 2
3.1.8. Роль 2 в развитии бактериофага Т7.
3.2. Изучение мутаций в факторе о, нарушающих взаимодействие фактора с корферментом РНКполимеразы . i.
3.3. Изучение механизма активации транскрипции
промотора vii i i
Список сокращений
Список литературы


И наконец, наиболее комплексным уровнем регуляции транскрипции является модуляция РНКполимеразы с помощью транскрипционных регуляторов белков. Транскрипционные регуляторы, разделяемые по оказываемому ими эффекту на активаторы и репрессоры транскрипции, используются клеткой как для глобальной регуляции транскрипции, так и для регуляции транскрипции отдельных промоторов и, таким образом, являются основным инструментом, обеспечивающим тонкую настройку РНКполимеразы. РНКполимеразу. Следует отметить, что изучение регуляции транскрипции во многом усложняется тем, что транскрипция многих генов находится под контролем одновременно нескольких регуляторов. Кроме того, регуляция транскрипции не является консервативной в эволюции, так что механизм ответа на один и тот же стимул может существенно различаться даже у близких видов. Роль нуклеотидной последовательности промотора. В результате сравнения нуклеотидных последовательностей промоторов было установлено, что промоторы, узнаваемые с помощью большинства сигма факторов, содержат два основных элемента гексануклсотидных мотива, обозначаемых и элементы, в соответствии с их расположением по отношению к старту транскрипции , , . И хотя оптимальные последовательности и элементов различны для разных сигма факторов, их расположение по отношению к старту транскрипции консервативно. Охолофермента, имеют уникальную структуру , i . Узнавание и элементов промотора происходит за счет ДНКбелковых взаимодействий с эволюционно консервативными районами, соответственно, 2 и 4 сигма фактора . Примечательно, что сила промотора в большинстве случаев коррелирует со степенью сходства и элементов промотора с консенсусными последовательностями , , , однако в то же самое время последовательность промоторов Е. Кроме собственно последовательности и элементов, на силу промотора также оказывает влияние и их взаимное расположение. Кроме того, на силу промотора может влиять и последовательность участка между и элементами , , . Важно отметить, что в отличие от элемента, элемент не является абсолютно необходимым элементом промотора. Можно отметить несколько способов функциональной замены элемента, описанных к настоящему времени. В первом случае роль второго базального элемента промотора берет на себя дополнительный элемент промотора. Так промотор не содержит последовательности, близкой к элементу, вследствие чего взаимодействие РНКполимеразы с областью промотора в районе элемента не является необходимым для его узнавания . . В данном случае роль второго базального элемента промотора берет на себя дополнительный мотив 3 нуклеотида, непосредственно прилегающие к элементу i, , , так называемый удлиненный элемент. То что удлиненный элемент является независимым промоторным элементом, подтверждается и тем, что в его узнавании принимает участие отдельный район фактора о7у эволюционно консервативный район 2. Вате . Вовторых, роль элемента промотора может играть белокрегулятор. Для этого сайт связывания регулятора должен находиться в районе, где обычно расположен элемент, так что при узнавании промотора взаимодействие консервативного района 4 фактора с элементом заменяется взаимодействием с белкомрегулятором. Примером подобной системы может служить белок , активирующий а зависимую транскрипцию средних промоторов бактериофага Т4 i, . И наконец, по крайней мере в одном описанном случае для узнавания промотора второй базальный элемент может быть вовсе не нужен. Сигма фактор , кодируемый бактериофагом Т4, не содержит района 4, отвечающего за взаимодействие с элементом. И хотя транкрипция поздних промоторов бактериофага холоферменгом, содержащим , значительно стимулируется другими белками бактериофага и , узнавание промоторов может осуществляться и в отсутствие дополнительных белков исключительно за счет взаимодействия в составе холоферменга с элементом i, i, .