Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз

• Автор: Хаустов, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 135 с. : ил.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Бесклеточныс белоксингезирующие системы

1.1.1. История создания

1.1.2. Бесклеточныс системы транскрипциитрансляции

1.1.3. Получение и состав

1.1.4. Энергетический обмен

1.1.5. Роль катионов

1.1.6. Различные типы систем

1.1.7. Реакторы для проведения биосинтеза белка

1.1.8. Получение чистой белоксинтезирующсй системы

1.2. Технологии получения искусственных генов
1.2.1. Искусственные гены в современной молекулярной биологии
1.2.2. Метод Кораны история синтез первого гена
1.2.3. Получение генов из частично комплементарных олигонуклеотидов
1.2.4. Стадии синтеза генов
1.2.5. Использование специализированных компьютерных программ
1.2.6. Развитие технологии синтеза олигонуклеотидов
1.2.7. Микросинтез олигонуклеотидов с использованием пикочипов
1.2.8. Способы объединения олигонуклеотидов
1.2.8.1. Ферментативное объединение олигонуклеотидов
1.2.8.2. Попарное объединение дуплексов с использованием ДНКлигазы
1.2.8.3. Синтез с помощью якорных и линкерных олигонуклеотидов
1.2.8.4. Множественное объединение олигонуклеотидов
1.2.8.4. Серийное клонирование
1.2.8.5. Репаративная достройка
1.2.8.6. Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР
1.2.8.7. Получение генов на микрочипах
1.2.9. Способы объединения синтетических сегментов
1.2.9.1. Объединение с помощью ПЦР
1.2.9.2. Объединение с помощью ДНКлигазы
1.2.9.3. Использование эндонуклеаз рестрикции типа II
1.2 Способы коррекции ошибок
1 Применение эндонуклеаз, узнающих неспаренности цепей ДНК
1 Фильтрация совпадений
1 Общее слияние
1 Гибридизация с селекционными олигонуклеотидам
1.2 Синтез вирусных геномов и мсгакластеров генов
1.2 Синтез генома микроорганизма
1.2 Другие проекты по синтезу геномов
1.2 Этические проблемы получения искусственного организма
1.3. Объект исследования плацен тарный ингибитор рибонуклеаз
2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Модификация нуклеотидной последовательности гена ИР
2.2.2. Условия ПЦР амплификации ДНК
2.2.3. Химикоферментативный синтез ДНК
2.2.4. Скрининг рекомбинантных клонов с помощью ПЦР
2.2.5. Удаление мутаций с использованием ПЦР
2.2.6. Очистка ДНК с помощью препаративного электрофореза
2.2.7. Ферментативные реакции и их детектирование
2.2.8. Обработка препаратов Т5 ДНКнуклеазой
2.2.9. Получение генетических конструкций
2.2.9.1. Клонирование синтетических сегментов гена ИР
.9.2. Получение генетической конструкции I
2.2.9.3. Получение генетических конструкций Ii и I
2.2.9.4. Получение генетических конструкций и
2.2.9.5. Получение генетических конструкций I и I
2.2 Получение компетентных клеток .i
2.2 Трансформация компетентных клеток .i
2.2 Выделение плазмидной ДНК из .i
2.2 Получение экстракта .i
2.2 Транскрипция РНК i vi
2.2 Выделение тотальной РНК .i
2.2 Экспрессия рекомбинантных генов в .i
2 Аналитическая экспрессия
2 Препаративная экспрессия
2 Коэкснрессия гена ИР с генами шаиеронов
2.2 Синтез белков в БСТТ на основе .i
2 БСТТ в формате
2 Диализная БСТТ открытого типа
2.2 Выделение ИР из телец включения
2 Выделение ИР растворением в 8 М мочевине
2 Хроматографическая очистка ИР в денатурирующих условиях
2 зависимая ренатурация ИР
2.2 Выделение ИР из клеточного экстракта .i
2.2 Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот
2.2 Определение концентрации общего белка
2.2 Определение концентрации по интенсивности флюоресценции
2.2 Электрофоретический анализ белков
2.2 Точное определение активности ИР
2.2 Оценка активности ИР с помощью электрофореза
2.2 Определение количества мРНК с помощью ГТЦРРВ
3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Оптимизация кодонового состава гена ИР
3.2. Разработка стратегии синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы
3.3. Анализ мутаций, возникших при синтезе ДНК
3.4. Исправление мутаций
3.5. Корректирование и клонирование синтетических ДНК
3.6. Получение полноразмерного гена ИР
3.7. Экспрессия гена ИР в .i
3.7.1. Экспрессия гена ИР в составе в .i
3.7.2. Коэкспрессия гена ИР с генами шаперонов
3.7.3. Коэкспрессия гена ИР с генами рибонуклсазы А и ангиогенина
3.8. Выделение ИР
3.8.1. Выделение ИР из телец включения
3.8.2. Разработка схемы очистки ИР из клеточного экстракта
3.9. Определение акгивности ИР
ЗЛО. Экспрессия гена ИР в БСТТ на основе .i
3 Получение БСТТ с использованием гена ИР Заключение Выводы
Список публикаций, выполненных по теме диссертации
Список литературы


Другой подход к совершенствованию БСТТ направлен на уменьшение содержания компонентов клеточного экстракта в пользу очищенных составляющих тРНК, РНКполимсраз, кофакторов транскрипции и трансляции. Это позволяет избежать присутствия нежелательных примесей, более тонко регулировать состав реакционной смеси, изучать функции любого из факторов трансляции. Единственным компонентом, получение которого сегодня невозможно без использования живых клеток это рибосомы. Работы по созданию искусственной рибосомы начались с попытки получения рекомбинантных рибосомальных белков малой субъединицы рибосомы . РНК. Как ни странно, но кодоновый состав генов таких важных для клетки компонентов, как рибосомапьные белки оказался неоптимальным при суперэкспрессии даже в ктетках . Использование БСТТ также не позволило добиться увеличения выхода белков. Решение этих проблем стало возможно благодаря развитию технологии химикоферментативного синтеза генов. С его помощью удалось получить оптимизированные гены всех белков субъединицы рибосомы и экспрессировать их в БСТТ с высоким уровнем продукции. Работа по объединшгшо рибосомальных РНК и белков с образованием фукнкциональной рибосомы не окончены. Можно также ожидать, что в ближайшие годы будут синтезированы гены всех белковых компонентов, участвующих в БСТТ, что позволит получать создать систему искусственного происхождения. Еще одним направлением совершенствования БСТТ может быть использование экспрессируемых генов белков, участвующих в реакции. Ингибитор рибонуклсаз ИР это неотъемлемый компонент БСТТ, функция которого заключается в защите РНК от ферментативного гидролиза. Традиционно ингибитор добавляют в реакционную смесь в виде очищенного белка, однако в процессе длительных реакций происходит его инактивация. Мы предположили, что использование ИР в виде экспрессируемого гена может привести к увеличению эффективности работы системы, поскольку в этом случае пополнение акгивного белка происходит за счет его постоянной продукции. Целью данной работы было получение бесклеточной системы транскрипциитрансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклсаз. Бескпеточные белоксинтсзирующие системы Бесклеточные белоксинтсзирующие системы ББС широко используются Б лабораторной практике для изучения биосинтеза белка и его регуляции, скрининга белков с неизвестными функциями, белковой инженерии i vi, аналитической и препаративной наработки рекомбинантных белков ii, . Основным преимуществом ББС является доступность их компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на биосинтез белка ионные условия, , ингибиторы, активаторы и т. В ББС можно заменять отдельные компоненты и избиратьно изучать их функции. Большинство результатов, полученных с помощью ББС, невозможно было бы получить при использовании живых клеток, погибающих при нарушении гомеостаза , . Биосинтез белка, который возможно моделировать в ББС, является одним из наиболее сложных и мультикомпонентных процессов живой клетки. В этой многостадийной реакции участвует около 0 различных типов биологических молекул, взаимодействующих между собой особым образом ii, . Биосинтез белка состоит из двух основных этапов транскрипции мРНК и ее трансляции с образованием белковой молекулы рис. Рис. Схема биосинтеза белка. Кроме указанных компонентов, в процессе участвуют факторы транскрипции и трансляции, системы регенерации энергии и аминоацнлирования тРИК. По материалам i , . История создания Демонстрация возможности белкового синтеза с использованием экстракта, полученного после разрушения клеток, была одним из важнейших достижений середины XX века, которые привели к рождению молекулярной биологии ii, . Рибонуклеопротеиновые частицы, осуществляющие биосинтез белка, были названы рибосомами. Благодаря возможности проведения белкового синтеза с использованием отдельных компонентов разрушенной клетки, удалось показать роль рибосом, как ключевых белоксинтезирующих машин , .