Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro

• Автор: Муреев, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристики бесклеточных систем трансляции

2.1.1 Бесклето чная система трансляции Е. i.

2.1.2 Проблема фолдинга

2.1.3 Лизат Ретикулоцитов Кролика i i .

2.1.4 Система Экстракта Зародышей Пшеницы x

2.1.5 Трансляционноактивные экстракты трипаносоматид

2.2 Бесклеточная трансляция в проточной системе

2.3 регенерирующие системы.

2.4 Применение бесклеточной системы

2.4.1 Включение модифицированных аминокислот.
2.4.2 I VI продукция мембранных белков.
2.4.3 Продуктивность и автоматизация. Применение i vi системы
экспрессии в геномике и протеомике.
2.4.4 Бесклеточная система трансляции используется для молекулярной
эволюции.
2.5 Активность I2 определяет уровень трансляции i viv i vi
2.6 Сплайслидер в инициации трансляции у трипаносоматид.
2.7 Использование i подхода для избирательного подавления
трансляции.
2.8 Инициация трансляции.
2.8.1 Проблемы инициации трансляции эукариот.
2.8.2 контекст
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Культивирование клеток ii .
3.1.1 Поддержание культуры клеток .
3.1.2 Трансфекция ii
3.2 Выделение митохондрий и анализ целостности внешней МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ.
3.2.1 Способы разрушения клеток
3.2.2 Процедура выделения митохондриальных фракций . .
3.2.3 Приготовление препаратов клеток и митохондрий для флуоресцентной микроскопии
3.2.4 Измерение активности сукцинатцитохром с дегидрогеназы и анализ
целостности внешней митохондриальной мембраны.
3.3 Получение экстракта . и трансляция
3.3.1 Процедура получения экстракта .
3.3.2 Обработка экстракта для подавления эндогенной трансляции.
3.3.3 Постановка и проведение реакции i vi трансляции
3.3.4 Получение суммарных гомологичных мРНК и . .
3.4 Очистка и I спектроскопия.
3.5 Поиск пре триплетов для .
3.6 Создание генноинженерных конструкций для геномной интеграции
3.6.1 Создание конструкций, содержащих iпоследовательность для
геномной интеграции в тубулиновый локус ii .
3.6.2 Создание плазмид с вариантами преА триплетов для геномной
интеграции в локус
3.6.3 Конструирование и экспрессирующих плазмид.
3.7 Создание конструкций для i vi экспрессии
3.7.1 Конструкции содержащие I элемент в качестве 5
не транслируемого участка.
3.7.2 Конструкции содержащие комбинацию обелинового 5 лидера с
нетранслируемым участком сателлита вируса некроза табака
3.7.3 Содание серии плазмид ОКНА, содержащих дополнительный в рамке с О , окруженный последовательностями полностью неструктурированных участков
3.7.4 Содание серии плазмид ОКНА, содержащих дополнительный в рамке с ОРС , окруженный последовательностями полностью 5 и
частично 3 неструктурированных участков
3.8 Методы Молекулярной Биологии.
3.8.1 Получение и трансформация компетентных клеток . i
3.8.2 Выделение плазмидной ДНК.
3.8.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами.
3.8.4 Обработка продуктов эндонукпеазного расщепления ДНК полимеразой фага Т4 для достройки выступающих концов до тупых
3.8.5 Лигирование ДНК
3.8.6 СеквенированиеДНК
3.8.7 ПЦР
3.8.8 Норзернгибридизация.
3.8.9 Гибридизация по Вестерну.
3.8. Анализ продуктов трансляции.
3.8. Транскрипция i vi.
3.8. Определение устойчивости РНК к нуклеазам VI Т
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Оптимизация параметров получения клеточного экстракта
4.1.1 Поиск наиболее щадящего метода разрушения клеток . .
4.2 Трансляция в экстракте . .
4.2.1 Оценка способности экстракта . к эндогенной трансляционной активности и инициации трансляции на экзогенновводимой гомологичной РНК.
4.2.2 Применение антисмыслового олигонуклеотида к последовательности сплайслидера, для подавления трансляции несущих РНК
4.2.3 Трансляция гетерологичных РНК в обработанном экстракте .
4.2.4 Сравнение эффективностей трансляции в , после обработки олигонуклеотидом и микрококковой нуклеазой
4.3 Экспрессия содержащих конструкций i viv в составе генных
КАССЕТ, ИНТЕГРИРОВАННЫХ В ГЕНОМ .
4.4 Создание оптимальных матриц длл трансляции лг vi
4.4.1 Влияние неструктурированного 5 на эффективность трансляции РНКматрицы
4.4.2 Трансляция РНК матриц, несущих оптимальный преА контекст и относительно легкоплавкий Зучасток окна, кодирующий гидрофильную лидерную последовательность
4.4.3 Сравнительный анализ степени структурных изменений, вызванных в РНК температурной денатурацией.
4.4.4 Оптимизация триплета, предшествующего .
4.5 ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Концентрация экстракта методами ультрафильтрации или диализом против , приближения состава и концентрации компонентов к цитоплазматическим и совершенствование системы АТР регенерации позволили достичь высокого выхода от 0. Табл. А i, . Показано, что увеличение выхода в формате было обусловлено возрастанием скорости инициации трансляции или же большей продолжительностью белкового синтеза. Появление первых проточных систем позволило значительно продлить время реакции и за счет этого увеличить выход продукта Табл. В, ii, . Табл. А и В, v, . В удельном отношении проточные системы часто оказываются менее эффективнее соответствующих багсЛвариантов поэтому оптимизация путем совершенствования регенерирующей системы и восполнения лимитирующих реакцию субстратов в проточных и, более легких в обращении, полупроточных систем позволила перейти на новый уровень синтеза и достигнуть очень высокого выхода продукта 1 мгмл для целого спектра изучаемых белков i, . I i см. Проточные системы, системы для регенерации . Изящная работа по сборке функционального трансляционного аппарата из отдельных компонентов была проделана в группе ii, . РНК синтетазы, рибосомы, а так же метионилтРНК трансформилазу и Т7 РНК полимеразу, АТР регенерирующую систему и необходимые низкомолекулярные компоненты. Система характеризовалась отличительной стабильностью АТР и РНК, что обеспечивало высокий выход , однако общая эффективность такой системы была все же ниже по сравнению с трансляцией в клеточных экстрактах Табл. К самым серьезным недостаткам прокариотической системы экспрессии относят нарушения в сворачивании эукариотических белков, а также преждевременную терминацию трансляции i, . Сворачивание белков происходит или начинается котрансляционно i, . Скорость элонгации полипептидной цепи у прокариот в 5 раз выше чем в эукариотах , , , что может препятствовать правильному сворачиванию мультидоменных эукариотических белков в прокариотической системе , . В связи с этим интересно отметить, что большинство белков . Для сравнения, у . Вопрос о соотношении в сворачивании полипептида ко и посттрансляционных составляющих для прокариот все еще остается нерешенным. Например, котрансляционное сворачивание было продемонстрировано для цепи галактозидазы i i, i i, , являющейся большим пятидоменным полипептидом сери нтрео ни новая РНОТОкиназа из ii котрансляционно связывала простетическую группу и принимала нативную конформацию см. Табл. Трудные белки. Чистая трансляционная система продуцировала правильно свернутые белки , не нуждаясь в шаперонах ii, . Несколько промежуточными выглядят результаты экспрессии в прокариотической системе миниантител v i i vi и i фрагментов. При экспрессии в мутантном штамме . Экспрессия i vi в экстракте . Табл. Трудные белки , . Интересно, что при экспрессии в экстракте пшеницы 0 миниантитела так же присутствовало в нерастворимой форме Табл. Несмотря на приведенные факты, практика показывает, что подавляющее большинство эукариотических белков трудноэкспрессируемо в прокариотической системе и требует для правильного фолдинга гомологичного эукариотического окружения. Еще в е годы исследователи продемонстрировали включение радиоактивномеченых аминокислот в гемоглобин в лизате ретикулоцитов , а. В году и i показали, что ретикулоцитарный лизат содержащий гемин, способен поддерживать белковый синтез на клеточном уровне в течение минут i, Предшественниками красных кровяных клеток являются ретикулоциты, утрачивающие ядро и полностью специализирующиеся на продукции глобиновых цепей. Вследствие специализации, ретикулоциты содержат функциональный гипертрофированный трансляционный аппарат. Концентрация рибосом в лизате достаточно высока и составляет 0. М оставаясь на порядок ниже средней внутриклеточной. Скорость синтеза глобиновых полипептидов I цепьРНКмин против , в интактном ретикулоците , , i, ivi i i i . Одним из главных свойств ретикулоцитарной системы является поддержание правильного фолдинга экспрессируемых белков млекопитающих. Это может объясняться подходящим гомологичным окружения , , например, участием шаперонов и шаперонинов при трансляции , . ЭПР для сворачивания и приобретения вторичных модификаций.