Структурная и функциональная характеристика генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы I делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe

• Автор: Шематорова, Елена Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с.

1. Структура и функции ядерной ДНКзависимой РПКполимсразы I эукариот обзор литературы.

1.1. Биологические особенности биосинтеза рибосомных РНК.

1.2. Промотор и базовые факторы транскрипции РНКполимеразы I эукариот.

1.3. Эиханссрные элементы и промоторы межгенных участков рибосомных генов.

1.4. Структурные элементы ДНК и белки, участвующие в терминации транскрипции,

осуществляемой РМКполимеразой Г

1.5. Субъединичный состав ядерной РНКполимеразы I эукариот.

1.6. Клонирование генов, кодирутрпих субъединицы РНКполимеразы

v. . .

1.7. Большие субъединицы ядерной РНКполимеразы I эукариот

1.8. Общие субъединицы РНКполимсраз 1 и Ш

1.9. Общие субъединицы ядерных РНКполимераз I, II и III
1 Малые специфические субъединицы РНКполимеразы 1.
1 Функциональная консерва тивность субъединиц РНКполимеразы 1 эукариот
1 Роль ионов цинка в ферментном комплексе РНКполимеразы 1.
1 Фосфорилирование субъединиц РНКполимеразы
1 Ортнизация ферментною комплекса РНКполимеразы I эукариот
1 Заключение
2. Струтегурная и функциональная характеристика генов, кодирующих субъединицы РНКполимеразы I делящихся дрожжей i результаты и обсуждение
2.1. Клонирование и функциональное тестирование кДИК и генов грс9 и . , кодирующих общие субъединицы РНКиолимераз I и III 9 и
2.2. Структурная и функциональная характеристика малых специфических субъединиц и РНКполимеразы I .
2.3. Исследования функциональной консервативности двух больших субъединиц РНКполимеразы I .
2.4. Клонирование кДК субъединицы 2 . и Лото i
и их функциональное исследование8
2.5. Анализ субъединичного состава РНКполимеразы . с помощью
I массспектрометрии и микросеквенирования отдельных субъединиц. .
3. Материалы и методы
3.1. Материалы.
3.2. Методы.
4. Выводы.
5. Список л и герату ры.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. аминокислотный остаток бд. акт. единица активности кДНК комплементарная ДНК ПААГ полиакриламидный гель п.о. пара оснований ПЦР полимеразная цепная реакция трис трисгидроксиметиламинометан АТР адснозин5трифосфат
I щелочная фосфотаза из кишечника теленка ii i
дитиотреит
этилендиаминтетраацетат
5 5фтороротовая кислота
дезоксинуклеозидтрифосфат
открытая рамка считывания i
полиэтиленгликоль
фенилметилсульфонилфторид
додсцилсульфат натрия i
7полимераза термостабильная ДНКполимераза из i i ЫЫДГтетраметилэтилендиамин термочувствительный мутант
ВВЕДЕНИЕ


Несмотря на то, что каждая клетка содержит многочисленные копии рДНК и нуждается в большом количестве рибосомных РНК, одновременно транскрибируется, как правило, только часть рибосомных генов. Число активно транскрибируемых рибосомных генов можно определить, обработав клеточную культуру аналогом аденозина, 5,6дихлор1 РОрибофуранозилбснзимидазоло. ДРБ. Эта процедура не влияет на активность РНКиолимсразы I, но приводит к раздроблению ядрышка на отдельные бусиновидные структуры. После обработки этих бусин антителами к РПКполимеразе I, можно подсчитать число активных транскрипционных единиц. Эта методика была использована для определения числа рибосомных генов, которые активно транскрибируются в фибробластах различных видов позвоночных, включая амфибий, птиц и млекопитающих. Во всех случаях транскрипция происходила далеко не на всех копиях рДНК в геноме . Альтернативным методом оценки числа активных рибосомных генов является обработка клеток псораленом, вызывающим перекрестные сшивки близлежащих участков ДНК. Гены, активно транскрибируемые РНКполимеразой I, очень чувствительны к этому реагенту, в то время как молчащие копии генов подвержены его действию в меньшей степени, повидимому, в силу того, что оми защищены нуклеосомами. С помощью этой методики было определено, что в логарифмической фазе роста в культуре клеток эритролейкемии мыши активными являются только рибосомных генов , а у дрожжей, растущих на богатой среде, транскрибируется около копий рДНК . Было установлено, что отдельные рибосомные гены либо легко доступны для псоралена, либо совсем не подвергаются воздействию этого реагента. Частичной чувствительности к псоралену в этих экспериментах обнаружено не было. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что рибосомный ген либо включен, либо выключен. Такое же заключение можно сделать на основе наблюдения активных и неактивных рибосомных генов в электронный микроскоп . Следовательно, РКполимераза I присутствует в клетке в избыточном количестве, активные гены полностью покрыты работающими РНКполимеразными комплексами, а лимитирующей стадией, повидимому, является образование стабильного прединициаторного комплекса на промоторе рибосомных генов. Количество некоторых компонентов этого комплекса в клетке, вероятно, ограничено, так как только часть промоторов используется для образования прединициаторного комплекса и инициации транскрипции. ДНК у разных организмов существенно различаются , . Одна из теорий, объясняющих такую дивергенцию регуляторных элементов, предполагает, что мутации в регуляторной области одного гена, которые благоприятно сказываются на его экспрессии, могут быстро распространяться в семействе последовательностей благодаря генной конверсии, неравному кроссинговеру и митотической рекомбинации. Поэтому сама повторяющаяся природа рибосомных генов предполагает быстрые эволюционные изменения, неизбежно ведущие к видовой специфичности регуляторных элементов. Как и предполагает эта гипотеза, промоторные последовательности обнаруживают мало сходства даже у относительно близкородственных видов, таких как мышь и человек. Однако положение и организация регуляторных элементов не только промоторов, но и энхансеров, терминаторов, а также нуклеотидных последовательностей, участвующих в рекомбинации и репликации рДНК практически одинаковы, даже если сами нуклеотидные последовательности между собой не имеют ничего общего. Промоторы РНКполимеразы I эукариот состоят из двух регуляторных элементов корового промотора , и расположенного перед ним дополнительного элемента рис. Эти элементы разделены нейтральной спейсерной последовательностью, длина которой строго фиксирована. У всех эукариот СР на 2 п. Первичная структура коровог о промотора обеспечивает специфичность транскрипции генов рРНК, и этой последовательности достаточно для инициации синтеза молекул рРНТС. Вместе с тем, присутствие в промоторной области рибосомных генов как правило, этот элемент расположен в интервале от 0 до значительно стимулирует транскрипцию . Рис. Модели комплексов инициации транскрипции, образующихся на промоторах рДК дрожжей и позвоночных.