Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens

• Автор: Митькевич, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. РИБОНУКЛЕАЗЛ БА, РОДСТВЕННЫЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Принципы классификации нуклеаз

1.2. Механизм каталитического действия циклизующнх рнбонуклсаз

1.3. Структура и свойства РНКазы Ба и подобных ей РНКаз

1.3.1. Структура и механизм действия РНКазы Ба

1.3.2. Каталитические свойства РНКазы Ба и ее гомологов

1.3.3. Термостабильность РНКазы Ба, ее гомологов и мутантов

1.4. Влияние остатков активного центра на стабильность белка

1.5. Ингибиторы рнбонуклсаз
1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы РНКаз
1.5.2. Белковые ингибиторы РНКаз
1.5.2.1. Барстар
1.5.2.2. Цитоплазматический ингибитор рибонуклеаз животного происхождения
1.6. Цитотоксичность РНКаз
1.6.1. Токсическое действие РКазы на клетку
1.6.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности РНКаз
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты и материалы
2.1.1. Бактериальные рибонуклеазы
2.1.2. Барстар А и его мутанты
2.1.3. Получение ЗЫгидроксиуреидоЗдезокситимидин 5фосфата
2.1.4. Использованные реагенты
2.2. Методы исследований
2.2.1. Измерение каталитических параметров реакций гидролиза субстратов РНКазамн
2.2.2. Определение жизнеспособности клеток в присутствии РНКазы
2.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия ДСК
2.2.4. Круговой Дихроизм КД
2.2.5. Измерение констант связывания
2.2.6. Определение концентраций
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Структурнофункциональный анализ активного центра РНКазы Ба
3.1.1. Роль остатков п и йМ 1 в связывании субстрата
3.1.2. Функциональная роль остатков и, Аде, Н1б и и
3.1.3. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Ба на сс активность
3.2. Конструирование ингибиторов РНКазы Ба и родственных ферментов
3.2.1. Ингибирование РНКаз мсталлохслатами
3.2.2. Ингибирование активностей РНКазы Ба и биназы ЗМгидрокснурендоЗдезокситимидин 5фосфатом в присутствии цинкаН
3.2.3. Ингибирование активности ип мутанта РНКазы Ба ЗЫгидроксиурсидоЗдсзокситимидин 5фосфатом в присутствии цинкаП
3.3. Изучение вклада остатков активного центра РНКазы Ба в конформационную стабильность фермента
3.4. Цитотоксичсские свойства РНКазы Ба, ее близких гомологов и мутантов с измененным зарядом
3.4.1. Изменение общего заряда молекулы с отрицательного на положительный делает РНКазу Ба цитотоксичной
3.4.2. Роль активируемых кальцием калиевых Кса каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами
3.4.3. Положительный заряд является основной детерминантой цитотоксичности микробных РНКаз
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Несмотря на большой интерес исследователей к цитотоксичным РНКазам, факторы, определяющие их цитотоксичность, до сих пор недостаточно изучены. Настоящая работа посвящена установлению молекулярного механизма действия и определению цитотоксических свойств РНКазы Б а из БпърЮтусез аигеоасют. Выбор этого фермента обусловлен тем, что РНКаза Ба является одним из наименьших ферментов, состоящим из аминокислотных остатков. Ее пространственная структура хорошо изучена как в кристалле, с разрешением 1 А , так и в растворе методом ЯМР , а небольшой размер молекулы позволяет в значительной степени варьировать свойства белка внесением минимальных изменений в его последовательность. Поэтому РНКаза Ба представляет собою удобную модель как для изучения взаимоотношений между белковой структурой и функцией, определяющих эффективность действия фермента, так и для исследования факторов, влияющих на конформационную стабильность белков в растворе. РНКазы Ба на конформационную стабильность фермента 4 исследование цитотоксических свойств РНКазы Ба, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом, оценка влияния отдельных клеточных компонент на цитотоксические эффекты, проявляемые РНКазами. Вес ферменты, участвующие в расщеплении нуклеиновых кислот, называются нуклеазамн. К ним относятся ферменты, специфичные к ДНК ДНКазы, к РНК РНКазы и семейство ферментов, которые могут расщеплять оба субстрата нуклеазы. Исходя из представлений о механизме действия нуклеаз, Бернард подразделял РНКазы на две группы фосфогрансферазы циклизующие РНКазы и фосфогидролазы. Фосфотрансфсразы используют 2ОН группу рнбозы нуклеотида для внутримолекулярной атаки на примыкающий атом фосфора. В результате образуются циклические 2,3фосфодиэфиры, которые затем гидролизуются до соответствующих нуклеозидЗмонофосфатов. Фосфогидролазы катшшзнруют прямую атаку водой 3,5фосфодиэфнрной связи в нуклеиновых кислотах. К фосфогидролазам относится группа мсталлозависимых РНКаз, расщепляющих Зфосфодиэфирные связи и образующих продукты с 5терминальным фосфатом. Циклизующие РНКазы являются эндонуклеазами. Они проявляют более или менее выраженную специфичность к природе нуклеозидов, примыкающих к расщепляемой фосфодиэфирной связи. Схема реакции гидролиза РНК циклизующими РНКазами представлена на рис. I. На первой сталии в результате трансэтерификацни происходит расщепление РНК на два олигонуклеотида. Один из них несет на Зконце 2,3циклофосфат, а второй на 5конце ОНгруппу. На следующей стадии цнклофосфат гидролизуется до Зфосфата . Первая стадия обычно протекает значительно быстрее, чем последующий гидролиз циклофосфата. РНКазы проявляют большую или меньшую специфичность к природе гетероциклического основания, находящегося на Зконце гидролизуемой фосфодиэфирной связи. По этому признаку они подразделяются на пирнмидинсиецифичпые КФ 3. КФ 3. РНКазы КФ 3. Первым широко изучавшимся представителем циклизующих РНКаз является бычья панкреатическая РНКазаА . Механизм каталитического действия РНКазы А был предложен Матиасом, Рабиным и соавт. На стадии циклизации один из них IIi играет роль общего основного катализатора, акцептируя протон 2ОН группы, а второй i роль общей кислоты, протонируя 50 атом уходящего нуклеотида. На стадии гидролиза циклофосфата роли остатков гистидина меняются i активирует атаку воды по механизму общего основного катализа, i2 выступает в роли общего кислотного катализатора, протонирующего уходящую группу. Нуклеофильное замещение у атома фосфора в реакции этого типа протекает как реакция присоединенияотщепления, в которой образуется промежуточное состояние с пентакоординнрованным атомом фосфора. Реакция протекает по механизму i i, т. Рис. Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз. На первой стадии в результате реакции трансэтерификации происходит расщепление РНК с образованием двух олигонуклеотидов. В и ВН боковые группы остатков активного центра РНКазы, выступающие в роли общего основания и общей кислоты, соответственно. На второй стадии, при гидролизе циклофосфата, эти остатки меняются ролями .