Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях

• Автор: Мещерякова, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Типы вирусных векторов для экспрессии пептидов и полипептидов в

растениях

1.2. Системы презентации эпитопов

1.2.1.Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов

1.2.2.Системы презентации эпитопов на основе сферических вирусов

1.3 Системы экспрессии полипептидов

1.3.1.Вектора, сконструированные по принципу замена гена

1.3.2.Вектора, сконструированные по принципу дополнительный ген

1.3.2.1 .Системы экспрессии полипептидов на основе палочковидных вирусов

1.3.2.2.Систсмы экспрессии полипептидов на основе сферических вирусов
1.4. Получение вирусоподобных частиц ВИЧ в растениях с помощью
вирусных векторов
1.5. Стратегии vi и vi
1.6. Векторная система на основе делеционного варианта РНК2 V
1.7. Системы презентации внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А
1.8. укяеокапсид вируса гепатита В человека как система презентации
эпитопов и полипептидов
1.9. Вирусы растений и нанотехнологии
1. Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растения и бактериальные штаммы
2.2. Животные
2.3. Штамм вируса гриппа
2.4. Питательные среды и антибиотики
2.5. Ферменты и коммерческие наборы
2.6. Реактивы и буфера
2.7. Синтетические олигонуклеотиды
2.8. Конструирование векторов экспрессии
2.9. Секвенирование ДИК
2 Приготовление компетентных клеток .ii для электропорации
2 Трансформация .i и агроинфильтрация растений .i и
V. ипшсиШа 6
2 Приготовление глицеринового стока культур АитеаЫепэ
2 Приготовление хрубого экстракта из листьев Улпщшсиаа для заражения
здоровых растений
2 Выделение вирусных частиц СРМУ
2 Выделение РНК из вирусных частиц СРМУ для ОГЦР анализа
2 Частичная очистка ВПЧ
2 Вестернблот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях
.ЬепОиитапа и V. нпК1си1аа
2 Получение очищенных препаратов ВПЧ
2 Иммуносорбентная электронная микроскопия ЕМ
2 Трансмиссивная электронная микроскопия ТЕМ
2 Иммунологическое мечение золотом
2 Исследование нммуногсиных и протсктивных свойств химерных вирусных
частиц СРМУМ2е
.Способ введения препарата, получение эмульсии, дозы и схема иммунизации
.Метод анализа специфических антител
.Электронная микроскопия
.Массспектрометрия
.Статистический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение ВПЧ в растениях с помощью векторов на основе ХВК и
полноразмерной РНК2 СРМУ
3.1.1.Конструирование векторов экспрессии на основе ХВК и СРМУ
3.1.2.3аражснис растений ЬетИштапа и V.ипшсиШа и характер развития
симптомов вирусной инфекции
3.1.3.Исследование экспрессии белка нуклеокапсида НВУ в растениях
3.1.4.Идентификация ВПЧ методом ЕМ
3.2. Получение ВПЧ с помощью векторной системы на основе
делеционного варианта РК2 СРМУ
3.2.1.А.Конструированис вектора экспрессии НВсАй на основе делеционного варианта РИК2 СРМУ
3.2.1.Б. Конструирование вектора экспрессии 2 на основе делеционного варианта РНК2 СРМУ
3.2.2.Агроиифильтрация растений У.Ьепат1апа векторными конструкциями рВтРДсоге и рВтРДсогеМ2е и анализ экспрессии вариантов
3.2.3.Электронномикроскопическое исследование препаратов ВПЧ
3.2.4.Исследование свойств ВПЧ методом иммунологического мечения
золотом
3.3. Система презентации внеклеточного домена М2бедка вируса гриппа А
М2еэпитопа человека и птиц на основе СРМУ
3.3.1.Конструирование векторов экспрессии внеклеточного домена
М2бслка вируса гриппа А человека и птиц на основе СРМУ
3.3.2.3аражение растений V ii и характер развития вирусной инфекции
3.3.3.Анализ генетической стабильности рекомбинантных вирусов
3.3.4.Выделение и анализ рекомбинантных вирусных частиц
3.3.5.Иммунизацияия мышей химерными вирусными частицами СРМУМ2еН и СРМУМ2еА
3.3.6.Изучсние протективного действия препарата СРМУМ2еН на модели летальной гриппозной инфекции
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Создание системы презентации эпитопов внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека и птиц на основе СРМУ. Исследование иммуногенных и протективпых свойств внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа Л человека в составе частиц СРМУ при иммунизации мышеи препаратами химерных вирусных частиц. Глава 1. Первыми вирусами растений, предложенными для использования в качестве потенциальных векторов экспрессии, были ДНКсодержащие вирусы , т. ДНК. Представители двух семейств ДНКсодсржащих вирусов растений ivii и iivii интенсивно исследовались в х годах на предмет возможности создания векторов экспрессии на их основе. Однако, по ряду причин, в частности, изза сложного механизма репликации через образование РНКинтермедиатов и механизма катящегоса кольца соотв. Большинство вирусов растений являются РНКсодержащими вирусами, геномы которых состоят из одной и более цепей РНК. Способность этих вирусов перепрограммировать инфицированную растительную клетку на продукцию вирусных белков легла в основу концепции использования этих вирусов для экспрессии рекомбинантных белков в растениях . Однако практическая реализация этой концепции стала возможна только после создания эффективной системы транскрипции i vi и получения полноразмерных инфекционных кДНК клонов геномов РНКсодержащих вирусов. Первый полноразмерный инфекционный кДНК клоп вируса мозаики костра V i Vi был получен в году , и это открыло практическую возможность создания векторов экспрессии на основе различных РНКсодержащих вирусов растений. При конструировании векторов экспрессии на основе РНКсодержащих вирусов растений используют два принципиальных подхода. Первый подход получил название система презентации эпитопов. Принцип заключается в том, что последовательности, кодирующие короткие антигенные пептиды эпитопы вирусной или бактериальной природы, встраивают в ген, кодирующий белок оболочки БО вируса таким образом, чтобы данный эпитоп экспонировался на поверхности вирусной частицы. Модифицированные таким образом вирионы, часто называемые химерными вирусами, предполагается использовать в качестве потенциальных вакцин нового поколения, т. Кроме того, экспрессия эпитопа как части макромолокулярной структуры, каковой является капсид вирусной частицы, значительно упрощает процедуру очистки, т. Второй подход, получивший название система экспрессии полипептидов, состоит в том, что в геном вируса встраивают ген целевого белка таким образом, что данный белок экспрессируется в инфицированной растительной клетке в свободном состоянии или в виде гибридов с другими вирусными белками, главным образом с белками оболочки. Как и РНКсодержащие вирусы животных, РНКсодержащне вирусы растений используют различные стратегии экспрессии генов, в частности субгеномные промоторы или синтез и последующий процессинг единого полипротсинапредшественника, и стратегия экспрессии определяет в конечном счете выбор конкретного методического подхода при конструировании вектора экспрессии на основе того или иного вируса. На сегодняшний день существует множество систем презентации эпитопов на основе РКсодержащих вирусов растений с различной архитектурой капсида, как сферической, построенной по принципу икосаэдрической симметрии, так и палочковидной, построенной по принципу спиральной симметрии. Основными требованиями к таким системам являются сохранение способности вируса к сборке в вирусные частицы и сохранение способности вызывать системную инфекцию при встраивании конкретного эпитопа в ген БО. Информация о топологии БО в составе вириона необходима для создания эффективных систем презентации эпитопов. ВТМ является типичным представителем семейства ТоЬаточчпбае. Геном ВТМ состоит из единственной цепн РНК размером 6,4 т. БО ,5 кДа, вирусная частица имеет палочковидную форму и размеры 0x нм. Геном вируса кодирует два белка, обеспечивающих репликацию, которые транслируются непосредственно с геномной РНК, транспортный белок и БО, которые транслируются с субгеномных мРНК. Таким образом, ВТМ использует две различные стратегии экспрессии белков слабый атЬегстоп кодон и синтез субгеномных мРНК.