Структурно-функциональная организация промоторной области межгенного спейсера генов p РНК у диплоидных пшениц

• Автор: Ахунов, Эдуард Диргатович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рибосомные РНК и структурные гены, кодирующие их

1.2. Структурнофункциональная организация межгенного спейсера

1.2.1. Субповторы МГС

1.2.2. Промоторы генов рРНК

1.2.3. Другие цисактивные элементы транскрипции генов рРНК 1.2.3.1 Энхансеры 3

1.2.3.2. Терминаторы транскрипции генов рРНК

1.3. Трансактивиые факторы транскрипции генов рРНК

1.3.1. РНК полимераза I
1.3.2. Фактор селективности промотора БЬ1
1.3.3. Фактор ЦВЕ
1.4. Регуляция транскрипции генов рРНК и ядрышковое доминирование
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Краткая характеристика объектов исследований
2.2. Выделение и очистка ДНК растений
2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.4. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК
2.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.6. Аналитический гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
2.7. Препаративный гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
2.8. Элюция ДНК из агарозных гелей
2.9. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры блоггинг
2 Радиоактивное мечение препаратов ДНК
2 Блотгибридизация ДНК
2 Амплификация участков мсжгенного спейсера рДНК методом полимеразной цепной реакции.
2 Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ЦР
2 Клонирование амплифицированных участков
межгенного спейсера рДНК
2 Подготовка компетентных клеток
2 Трансформация компетентных клеток КсоИ плазмидной ДНК
2 Секвенирование ДНК ферментативным методом
2 Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях секвенирующий гель
электрофорез
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Бактериальные штаммы, плазмидные и фагмидные вектора,
рекомбинантные плазмиды
2 Выделение и очистка РНК растений.
2 Определение сайта инициации транскрипции генов рРНК методом удлинения праймера.
2 Приготовление протопластов из проростков диплоидной пшеницы Т.Ьоеоисит
2 Трансформация протопластов Т.Ьоеоисит методом
химически индуцированною эндоцитоза
2 Реактивы и материалы Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Нуклеотидные последовательности отдельных участков МГС
рДНК диплоидных пшениц и эгилопсов
3.2. Определение СИТ генов рРНК у диплоидных пшениц
3.3. Инициация транскрипции с промотора генов рРНК в системе транзиентной экспрессии в трансформированных протопластах
3.4. Определение наличия промоторов генов рДНК, присущих геному А, в составе сложного гексаллоидного
генома Т.аеьИуит
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Промоторный участок МГС рДНК диплоиных пшениц
4.2. Сайт инициации транскрипции генов рРНК диплоидных пшениц
4.3. Транзиентная экспрессия в трансформированных протопластах
4.4. Диплоидные пшеницы как доноры генома А со слабым ядрышковым организатором
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Необходимо отметить, что познание тонких механизмов регуляции транскрипции полиплоидного генома, в том числе, и такой его важной части как рДНК, может позволить в будущем, используя эти сведения, рационально подбирать доноры пшениц и эгилопсов для создания новых форм с наиболее полезными для человека признаками, поскольку этот процесс требует предварительной детальной оценки геномного материала и определения эффективности его функционирования в синтетических гибридах. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции ii i xi, США, , Девятом международном симпозиуме по генетике пшеницы , Канада, и на Втором съезде биохимического общества РАН Москва, . Публикации. Основные результаты диссертации изложены в четырех печатных работах, а также депонированы в международных банках данных . Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования глава 3 и их обсуждения глава 4, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 7 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 8 страницах и содержит рисунков. Глава 1. К одному из важнейших функциональных компонентов клетки эукариотических и прокариотических организмов можно отнести белоксинтезирующий аппарат, представленный большим количеством рибосом, закрепленных на мембранных структурах клетки, либо же несвязанными свободными рибосомами, встречающимися в цитоплазме. Рибосомные частицы задействованы на одном из последних этапов реализации генетической информации клетки, закодированной в последовательности нуклеотидов в ДНК, в ходе которого происходит трансляция последовательности матричной РНК, представляющей из себя слепок определенного гена, в аминокислотную последовательность впоследствии формирующую активную белковую молекул. По причине важности функций, выполняемых рибосомами в клетке, их всестороннему изучению уделяется особое внимание. Прежде всего огромный интерес для исследователей представляет выяснение особенностей регуляции процесса синтеза компонентов рибосомных частиц, происходящего в ядре клетки. Рибосома представляет из себя сложный белковорибонуклеотидный комплекс, включающий в себя рибосомные РНК рРНК и белки. Таким образом, для синтеза всех компонентов функционирующей рибосомы, эукариотической клетке требуется координированная транскрипционная активность всех трех типов РНК полимераз, присутствующих в ядре клетки РНК полимераз I, II и III. РНК. Причем на долю этой I полимеразы приходится до всей синтезируемой РНК клетки. Эукариотические рРНК представлены двумя высокомолекулярными РНК с константами седиментации и , и двумя низкомолекулярными 5,8 и 5 рРНК. Гены, кодирующие рРНК, за исключением 5 рРНК, локализованы в участках хромосом называемых ядрышковыми организаторами и расположенных в области вторичной перетяжки i, , которая, в свою очередь, образуется из транскрипционноактивных участков рДНК, в то время как транскрипционнонеактивные гены рРНК в хромосомах формируют хромомеру, прилегающую к центромере хромосомы. В тех случаях, когда все гены рРНК, расположенные на одной хромосоме, неактивны, как это иногда наблюдается у некоторых аплополиплоидных видов растений формирование вторичной перетяжки не происходит Навашин, . Впоследствии из участка хромосомы, соответствующей вторичной перетяжке, в интерфазе клеточного цикла происходит формирование транскрипционно активного ядрышка, видимого в световой микроскоп как темное плотное образование в ядре клетки, в кагором сосредоточены практически все стадии биогенеза рибосом, включая процессы, связанные с транскрипцией рДНК, процессингом прерРПК и взаимодействием рРНК с рибосомными белками см. , , . Более детальное изучение ядрышка с использованием электронной микроскопии выявило три компонента, входящих в его состав светлый фибриллярный центр, прилегающий к нему плотный фибриллярный компонент, и гранулярный компонент с хорошо оформленными 1ранулярными структурами, предположительно являющимся прсрибосомами , .