Клонирование и исследование нового гена Camello в раннем развитии Xenopus laevis

• Автор: Попсуева, Анна Эдуардовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ .

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Раннее развитие X vi .

Гены, участвующие в эмбриональной индукции .

Регуляция клеточных движений на сталии гаструлы

Семейство ацстнлтрансфсраз .

1. Функции ацстнлтрансфсраз ы цитоплазме .

2. Ялсрные ацетилтранеферазы .

3. Ацетилироваиие сналовых кислот в комплексе Гольджи

Комплекс Гольджи. Распределение мембранных белков между эадоплазматнческнм ретакулумом и комплексом Гольджи
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Биологический материал
2. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов X vi
3. Клонирование гена X .
4. Секвенированне. анализ последовательности кДНК
5. Создание генных конструктов в экспрсссионных шшмидных векторах
6. Анализ экспрессии гена Xi в ходе развития X vi
7. Анализ иросгрансгвенной картины экспрессии гена X .
8. Микроинъекции мРНК X, синтезированной i vi, в эмбрионы X .
9. Культивирование клеток 1, экспрессия рекомбинантного белка
и прижизненное окрашивание ядер
. Фракционирование 1 клеток .
. Экспрессия белка в ооцитах X, фракционирование клеточного содержимого .
. Исследование внутриклеточной локализации X с помощью конфокальной микроскопии
. Гистологическая обработка и световая микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клонирование нового гена Xi vi .
Новое генное семейство .
Исследование области и времени экспрессии гена X .
Исследование функций X во время раннего развития X .
Исследование внутриклеточной локализации белка X .
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Процесс гаструляции начинается на дорсальной стороне, где клетки мезодермы ниволюнруют через губу бластопора и движутся но крыше бластоцеля к аномальному полюсу. При этом эндодерма постепенно втяшвается внутрь, а эктодермальные клетки стекают с аннмального полюса вниз и к концу гаструляции покрывают весь зародыш . Последние несколько лет большое внимание уделяется изучению молекулярных механизмов, лежаших в основе этих процессов, хотя полрежиему довольно мало известно о тонкой регуляции морфогенетических движений. Известно, что дорсальная губа бластопора и возможно вся зона ииволюирутошей мезодермы являются источниками сигналов, координирующих гаструляционныс движения и определяющих прямо или опосредованно специализацию тканей . . i , i , . Поэтому мы поставили перед собой задачу най ги гены, экспрессирующиеся в этой облает на стадии гаструлы. Темой данной работы является исследование структуры и функций мезодермально соецефичиого гена шпорцевой лягушки X vi, принадлежащего к открытому нами семейству генов . Оощгты X vi имеют все типичные черты женских гамет они гаплоидны, имеют значительные, но сравнению с соматическими клетками и спермиями, размеры около 1 мм в диаметре, содержат разнообразные запасные вещества и окружены сложной оболочкой. В цитоплазме ооцита содержатся питательные вещества, рибосомы и тРНК, значительные запасы которых обеспечат бурный синтез белка сразу после оплодотворения, а также материнские мРНК в неактивном состоянии. Кроме того, в цитоплазме ооцита неравномерно распределены морфогенетические факторы белки, направляющие дифференцировку тканей и органов при дроблении они распределяются между различными клетками , I7. Непосредственно над цитоплазматической мембраной лежит тонкая желточная оболочка, образованная гликопротеинами. Она играет важную роль в обеспечении вндоспецнфичпости оплодотворения. Над ней толстая студенистая внттелиновоя оболочка, образованная также гликопротеинами, и участвующая в привлечении спсрмнсв. Пол плазматической мембраной находится слой кортикальной цитоплазмы. Кортикальная цитоплазма болсс вязкая, чем глубокие слои, и содержит кортикальные гранулы и глобулярный актин в высокой концентрации. По распределению желтка, яйца X мезолсцитальиыс, желток скапливается в вегетативном полюсе, у них хороню видны светлый вегетативный в пигментированный аннмальный полюса i. К моменту проникновения спермня. , . Существует механизм, предотвращающий полиспермию н состоящий из двух фаз быстрой и медленной. Мембранный потенциал у оопита в нормальном состоянии состовляет около мВ. Он определяется разностью концентраций ионов калия и натрия. Цитоплазматическая концентрация ионов калия больше, чем во внеклеточном пространстве, а натрия, наоборот, меньше. После слияния клеточных мембран ооцита и первого спермия, в цитоплазму яйца поступают ионы натрия, в результате мембранный потенциал становиться положительным и достигает мВ, что делает невозможным связывание других сперматозоидов. С момента проникновения сперматозоида до изменения мембранного потенциала в положительную сторону проходит всего 0. , , поэтому этот процесс называют быстрым блокированием полиспермии. Он был изучен на морском еже. I i, . Но мембранный потенциал сохраняется положительным не больше минуты и этого времени недостаточно для предотвращения множественного оплодотворения яйцеклетки. Существует второй, механический блок полиспермии, который связан с кортикальной гранулярной реакцией и развивается через 1 минуту после связывания сперматозоида с яйцом. Реакция заключается в Са2 зависимом слиянии кортикальных гранул с плазматической мембраной, при этом их содержимое высвобождается в пространство между плазмалеммой и желточной оболочкой. Протсолнтнческнс ферменты, содержащиеся в гранулах, растворяют белки, прикрепляющие желточную оболочку к плазматической мембране, а осмотически активные вещества мукополнсахаридн привлекают в это пространство воду. В результате желточная оболочка отходит от плазмалеммы.