Разработка и использование методов направленной модификации целевых генетических локусов хромосомы E. coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот

• Автор: Каташкина, Жанна Иосифовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил

1. Инициация транскрипции в .i.

1.1. Структура IIполимеразы. Разнообразие стсубъединиц и их роль в регуляции экспрессии генов

1.2. Основные стадии процесса инициации транскрипции

1.3. Элементы структуры промоторов, узнаваемых Ест

1.4. Регуляция промоторов, узнаваемых Ест.

1.5. Промотор лактозного оперона

2. Современные методы конструирования бесплазмидных штаммов

проду центов.

2.1. Гомологичная рекомбинация в .i.

2.2. Интеграция линейных молекул ДНК в и штаммах .i

2.3. Методы интеграции линейных молекул ДНК в хромосому штамма дикого типа.

2.4. Использование плазмидной интеграции для введения мутаций в хромосому .i
2.5. и зависимая интеграция линейных молекул ДНК.
2.6. Использование систем сайтспецифической рекомбинации для интеграции, клонирования фрагментов ДНК и удаления генетических маркеров
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Бактериальные штаммы, плазмидные и фаговые ДНК
Генноинженерные методики .
Проведение полимеразной цепной реакции
Оценка силы промоторов по устойчивости клеток к хлорамфсииколу. Определение активности галактозидазы в экстрактах бактериальных
Электрофорез клеточных белков.
зависимая интеграция промотора .
Р1 трансдукция
Интеграция линейной ДНК в хромосому штамма .i .
Электрогрансформацня клеток .i.
зависимая интеграция линейных фрагментов ДНК.
Удаление антибиотического маркера из хромосомы .i К с
использованием функций IXi фага X
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Клонирование известных и создание новых регуляторных элементов .i и исследование их свойств
1.1. Создание вектора для клонирования промоторов
1.2. Клонирование промоторов, узнаваемых РНК полимеразой Ет .i, и оценка их силы
1.3. Молекулярное клонирование и оценка относительной эффективности рнезависимых терминаторов транскрипции и .
1.4. Конструирование новых промоторов и исследование их свойств
1.4.1. Промоторы Рдсi и i
Конструирование гибридных промоторнооператорных элементов. Исследование свойств новых промоторов
1.4.2. Промотор юс
1.5. Создание плазмидпомошников I и I.
2. Создание и использование удобных интегративных систем
2.1. Удаление генетического маркера с использованием функций I и Xi фага X
2.2. Получение немаркированных делеций с использованием продуктов генов системы и ixi бактериофага X
2.3. Модификация нативной регуляторной области целевого гена в бактериальной хромосоме с использованием раз IXiзависимой системы.
2.3.1. Замена нативной регуляторной области на известный прокариотический промотор
2.3.2. Оптимизация экспрессии целевого хромосомального гена путем использования синтетического промотора с вырожденной последовательностью области
Определение коэффициента репрессии новых промоторов, полученных в результате варьирования области промотора Рмс.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


В холе работы осуществлено создание удобного генноинженерного инструментария, предназначенного для конструирования немаркированных мутаций бактериального генома получения специфических делений, модификации регуляторных областей генов и оперонов. Разработанная система удаления селективного антибиотического маркера нашла широкое применение в ходе работ по конструированию бактериальных продуцентов. Впервые показана принципиальная возможность оптимизации уровня транскрипции генов, локализованных непосредственно в бактериальной хромосоме, путем рандомизации функционально значимой области их промоторов. В ходе этих работ получена коллекция Рвсподобных промоторов различающихся по эффективности инициации транскрипции не менее чем на два порядка величины. В процессе создания штаммовпродуцентов аминокислот, нуклеотидов и других биологически активных веществ приходится решать сложную задачу скоординированного изменения уровней экспрессии целого набора генов, т. Уровень экспрессии гена, т. РНК, инициация трансляции, наличие в структурной части гена редких кодонов, стабильность и токсичность образующегося белкового продукта и т. Из всех перечисленных факторов только инициация транскрипции может при некоторых допущениях рассматриваться как процесс, не зависящий от нуклеотидной последовательности структурной части конкретного гена. Это позволяет поставить задачу создания универсального инструментария, подходящего для оптимизации транскрипции практически любых генов, которая и решалась в ходе представляемой работы. Поэтому первая часть данного Обзора литературы посвящена описанию процесса инициации транскрипции в Е. И, в ней рассматривается структура промоторных областей,узнаваемых РНКполимсразой в комплексе с о субъединицей и влияние тех или иных особенностей первичной структуры этих областей на эффективность инициации транскрипции. Кроме того, рассматривается участие регуляторных белков в процессе инициации транскрипции. С другой стороны, в ходе работы решалась задача разработки новых или усовершенствования имеющихся методов, позволяющих создавать бесплазмидные штаммы Е. И с оптимизированными уровнями экспрессии интересующих нас генов. Поэтому во второй части Обзора литературы рассматриваются современные методы модификации бактериальных хромосом, включая методы получения делеций, введения точечных замен, переноса мутаций в. Описаны некоторые способы решения проблемы селективных маркеров использование контрселективных маркеров, излечивание от маркеров. Инициация транскрипции в . Процесс инициации транскрипции в . И тем не менее, в настоящее время происходит очень быстрое накопление новой информации об этом процессе и интерес к этим исследованиям не ослабевает, поскольку регуляция экспрессии генов происходит преимущественно на уровне инициации транскрипции. В литературе описаны разнообразные системы регуляции транскрипции, в каждой из которых задействованы особые регуляторные факторы i,. Vi, . Инициация транскрипции это сложный, многостадийный процесс белокнуклеинового взаимодействия. Известно огромное количество факторов белковой и небелковой природы, участвующих в нем в тех или иных случаях, однако основными и постоянными участниками этого процесса являются молекула ДНК и ДНКзависимая РНКполимераза. Структура РНКполимеразы. Разнообразие стсубъединиц и их роль в регуляции экспрессии генов. Мультисубъединичные ферменты, ДНКзависимые РНКполимеразы эволюционно консервативны и присутствуют во всех видах i, и Еисагуа, обнаруживаются в хлоропластах растений и у некоторых видов вирусов. В ядрах эукариотических клеток присутствуют зри различные РНКполимеразы. РНКполимераза I синтезирует рРНК, РНКполимераза II осуществляет синтез мРНК и некоторых мяРНК, РНКполимераза III синтезирует 5 рРНК, тРНК и некоторые мяРНК. В клетках прокариот, в том числе . РНК, включая рРНК, мРНК и тРНК, осуществляется единственной РНКполимеразой. Фермент IIполимсраза . Х2 ст. Кроме того, в се составе идентифицирована сосубъединица, однако она не является необходимой для процесса транскрипции и для выживания клеток. Четыре субъединицы РНКполимеразы . Эта часть РНКполимеразы достаточна для осуществления элонгации транскрипции РНК, но не способна корректно осуществлять инициацию транскрипции.