5S рРНК-белковый комплекс Thermus thermophilus: исследование структуры белка TL5 и его взаимодействия с РНК

• Автор: Мещеряков, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 99 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурные исследования рибосом и

рибосомных компонентов

1. Детали структурной организации рибосомы.

1.1. Электронномикроскопические исследования структуры рибосомы

1.2. Кристаллографические исследования структуры рибосомы.

1.2.1. Структура рибосомной субчастицы i

1.2.2. Структура рибосомной субчастицы ii

1.2.3. Структура рибосомы i.

1.3. Структурные исследования рРНК белковых комплексов.

1.3.1. Структура комплекса белка 1 с фрагментом рРНК
1.3.2. Центральный домен субчастицы
1.3.2.1. Структура комплекса белка с фрагментом
рРНК . i ,.
1.3.2.2. Структура комплекса белков , 6 и с фрагментом
рРНК . i.
2. 5 рРНК белковый комплекс
2.1. Структура 5 рРНК.
2.1.1. Первичная и вторичная структура 5 рРНК.
2.1.2. Третичная структура 5 рРНК.
2.2. Белки 5 рРНК белкового комплекса3.
2.2.1. Белок .
2.2.2. Белок .
2.2.3. Белок 5
2.2.4. 5 рРНК связывающие белки эукариот
2.2.4.1. Рибосомные белки.
2.2.4.2. Фактор транскрипции III.
2.3. Расположение в рибосоме и функция
5 рРНК белкового комплекса
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
1.1. Химические реагенты и ферменты
1.2. Буферы
1.3. Среды.
2. Методы.
2.1. Получение компетентных клеток . i
2.2. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК
2.3. Экспериментальные процедуры при работе с белками
2.3.1. Электрофорез в ПААГ
2.3.2. Суперпродукция белков в клетках . i
2.3.3. Выделение рибосомного белка 5 из
штамма суперпродуцента.
2.3.4. Выделение фрагмента белка 5 i из
штамма супсрпродуцента.
2.3.5. Определение коэффициента экстинкцин
2.4. Экспериментальные процедуры при работе с РНК
2.4.1. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях.
2.4.2. Электрофорез РНК в нативных условиях.
2.4.3. Выделение 5 рРНК
2.4.4. Получение фрагментов 5 рРНК.
2.4.5. Транскрипция РНК.
2.4.6. Радиоактивное мечение РНК но 5 концу
2.5. Определение констант диссоциации РНК белковых комплексов методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах
2.6. Кристаллизация РНК белковых комплексов
2.7. Замораживание кристаллов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. РНК связывающие свойства белка 5.
2. Получение фрагментов 5 рРНК, связывающих белок 5
3. Кристаллизация комплексов
4. Подготовка кристаллов к сбору дифракционных данных.
Получение тяжелоатомных производных
5. Структура комплекса белка 5 с фрагментом 5 рРНК . i
при разрешении 2.3
6. Изучение сборки бактериального 5 рРНК белкового комплекса
6.1. Кооперативное взаимодействие белков 5, 5 и МЛ
с 5 рРНК. Роль Сконцевого домена белка 5.
6.2. Получение фрагмента 5 рРНК, взаимодействующего
с белком 7
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Известно, что белки и нуклеопротеиды из экстремальнотермофильных организмов обладают повышенной устойчивостью к внешним воздействиям и поэтому могут оказаться наиболее перспективными объектами для кристаллизации и рентгеноструктурного анализа. В лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН ведется работа по выделению, кристаллизации и структурным исследованиям ряда компонентов белоксинтезирующей системы из экстремальнотермофильного микроорганизма ТНегтт ЬегторИИш. Одним из направлений этой работы является изучение 5Б рРНК белкового комплекса. Цель данной работы исследование структуры одного из трех рРНК связывающих белков Т. Белок 5 не имеет выраженной гомологии ни с одним из известных рибосомных белков v . Однако его концевая часть обладает некоторой гомологией с белком из ii i. В нашей лаборатории было показано, что концевой фрагмент белка 5 защищается 5 рРНК от гидролиза трипсином . рРНК. В данной работе нами было показано, что именно концевая часть белка 5 взаимодействует с РНК, тем самым было экспериментально подтверждено высказанное ранее предположение о роли этого участка белка. Нами был локализован район 5 рРНК, взаимодействующий с белком 5. Было показано, что белок 5 взаимодействует с петлей Е 5 рРНК. Были получены фрагменты РНК различной длины, содержащие сайт связывания белка 5. Эти фрагменты были использованы для получения стабильных РНК белковых комплексов и их кристаллизации. Нами были получены кристаллы комплексов белка 5 с различными фрагментами 5 рРНК Е. Лучшие кристаллы давали диффракционную картину с разрешением 2. А. Эти кристаллы были использованы для определения структуры комплекса. Работа по решению структуры комплекса 5 велась совместно с группой структурных исследований рибосомных белков Институт белка РАН и лабораторией профессора А. Лильяса Лундский Университет, Швеция. В настоящей работе было также показано, что все три 5 рРНК связывающих белка Т. 5, и 5, взаимодействуют с 5 рРНК кооперативно. При этом было установлено, что встраивание рибосомного белка 7V5 в 5 рРНК белковый комплекс стимулируется Сконцевым доменом белка 5. Кроме того, был впервые получен фрагмент 5 рРНК, способный специфически взаимодействовать с белками и 5, как по отдельности, так и совместно. Структурные исследования рибосом и рибосомных компонентов 1. Во всех живых клетках процесс синтеза белка осуществляется с помощью рибосом. Знание детального устройства рибосомы необходимо для понимания молекулярных механизмов этого процесса. Структурные исследования рибосомы широко ведутся уже на протяжении лет, но только в послсдгшс годы, благодаря значительным достижениям в области криоэлектронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии, были получены структуры отдельных рибосомных субчастиц с атомарным разрешением. Первоначальные данные о морфологии рибосом были получены еще в е годы с помощью электронной микроскопии ЭМ с использованием методов негативного контрастирования или оггенения металлом. Полученные модели Viiv, и субъединиц , Viiv , достаточно точно описывали их морфологию. Согласно этим моделям, субъединица представляет собой вытянутую частицу длиной 00, имеющую головку и асимметричное тело с боковой лопастью, разделенные бороздой. субъедшгица более изометрична, имеет тело, центральный протуберанец и два неодинаковых боковых выступа, один из которых палец образован белками 7, а другой белком 1. При формировании рибосомы головка малой субъединицы примыкает к центральному протуберанцу большой субъединицы, а лопасть обращена к выступу, образованному белком I , Viiv . Значительный прогресс в исследованиях структуры рибосомы и рибосомных субъединиц методом электронной микроскопии в середине х годов был связан с использованием техники трехмерной реконструкции изображений замороженных частиц .