Разработка новых методов иммуноанализа на примере миоглобина человека

• Автор: Рошке, Виктор Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 153 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современное состояние методов насыщающего иммуноанализа

2.1. Общая характеристика насыщающего иммуноанализа .

2.2. Аналитические характеристики.

точность.

чувствительность

специфичность

достоверность

2.3. Методическая база насыщающего иммуноанализа

очистка лигандов.

специфичные антитела
методы разделения свободной и связанной фракций.
меченый лиганд и разновидности насыщающего иммуноанализа .
2.4. Радиоиммуноанализ
йодирование белков. .
введение йода в соединения небелковой природы .
техника радиоиммуноанализа.
2.5. Альтернативные методы насыщающего иммуноанализа
энзимоиммуноанализ.
кофакторный иммуноанализ.
мембранный иммуноанализ .
флуоресцентный иммуноанализ .
2.6. Заключение
3. ЭКСПЕРШЕНТАЛЪНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Материалы
3.2. Препаративные биохимические методы
3.3. Синтетические методы
3.4. Модификация белков
3.5. Иммунохимические методы.
3.6. Физикохимические и биохимические методы анализа
3.7. Обработка данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Разработка иммунохимической системы миоглобин антитела против миоглобина.
выделение и очистка миоглобина из сердечной мышцы человека
получение антисыворотки против миоглобина человека
специфичность иммунохимической системы миоглобинантитела против миоглобина . .
4.2. Разработка быстрого метода радиоиммуноанализа на миоглобин, пригодного для экспрессдиагностики острого инфаркта миокарда
введение I в миоглобин.
оптимизация системы радиоиммуноанализа.
характеристики качества анализа .
исследование образцов сыворотки доноров и пациентов возможность применения метода для диагностики острого инфаркта миокарда .
4.3. Мембранный иммуноанализ
получение реакционоспособных липосом и их взамодействие с белками
комплементзависимнй лизис липосом, сенсибилизированных миоглобином
4.4. Система иммуноанализа на миоглобин с использованием АТР в качестве метки АТФметрический иммуноанализ
получение и характеризация меченого АТР миоглобина ИЗ
АТФметрический иммуноанализ на миоглобин. . . . Ц
возможности применения АТФметрического иммуноанализа для определения миоглобина и других клинически важных соединений в сыворотке крови.
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУШ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В дальнейшем в рамках данной работы будут рассмотрены методы типа 2, получившие в литературе название иммуноанализ или насыщающий иммуноанализ 8. с лигандом р . На основании закона действующих масс Экинз и соавт. концентрация свободной фракции. Уравнение 2 описывает гиперболу в координатах р рис. I 8II. Физический смысл имеет участок гиперболы, расположенный в области положительных и р , представляющий собой калибровочную функцию распределения лиганда от его концентрации. Графический вид функции существенно зависит от относительной концентрации антител и значения К . Для практических целей необходима достаточно крутая зависимость . 8 рис. Б, т. С тем, чтобы при изменении Р менялось бы достаточно сильно. С возрастанием величины К при фиксированном р также увеличивается крутизна зависимости от р 8, 9 рис. I. Таким образом, принцип насыпающего иммуноанализа состоит в насыщении специфичных антител возрастающими концентрациями лиганда и измерении его распределения между свободной и связанной фракциями. Внесение в систему стандартного количества меченого лиганда обеспечивает метод регистрации этого распределения по принципу изотопного разбавления. Кроме того, в рамках данной модели меченый и немеченый лиганд неотличимы. В реальной иммуноаналитической системе ситуация значительно сложней. Теоретический анализ с учетом этих факторов выполнен рядом авторов 8, . Однако, точное определение параметров, входящих в соответствующие выражения для р затруднительно, и на практике теоретически расчитанные калибровочные кривые обычно не используют. Вместо этого строят экспериментальные кривые зависимости распределения метки от концентрации немеченого лиганда по данным анализа стандартных образцов. Наиболее простой способ построения калибровочного графика метод построения по точкам в координатах метка сигнал в выделенной фракции концентрация немеченого лиганда. Эквивалентной формой являются координаты Рд или рд концентрация немеченого лиганда, где В и концентрации связанной и свободной метки, соответственно, а Т общая концентрация метки в пробе . Статистически наиболее оправданным способом выражения распределения метки является ИЛИ при условии, что измерение проводят как в связанной, так и в свободной фракциях 9, II. На практике чаще проводят измерение лишь одной из этих величин. Математические методы, получившие распространение в связи с развитием компьютерной техники, представлены двумя подходами регрессионным и интерполяционным , . Рис. I. Теоретическая зависимость распределения от концентрации лиганда р . На вставке приведена вся гипербола, крупным планом изображен участок, соответствующий положительным значениям и р . Значения и к приняты за 1. Размерность р и массаобъем, к объеммасса 9. Б Влияние на форлу кривой изменения концентрации антител, 8. Влияние на форму кривой изменения константы ассоциации, К 8. Регрессионный подход основывается на допущении, что калибровочный график, преобразованный некоторым образам, представляет собой функцию определенного аналитического вида, обычно линейную. Параметры функции устанавливают методом наименьших квадратов. Наибольшее распространение среди регрессионных методов получил i метод, предложенный Родбардом и др. В прир0. Ь параметры, вычисляемые методом наименьших квадратов. В интерполяционном подходе функция подбирается таким образом, чтобы ее значения в точках, соответствующих концентрациям стандартов, в точности соответствовали экспериментальным данным. Обычно для этого применяют полиномы высших степеней и сплайн функции , , . Интерполяционные методы полностью опираются на экспериментальные данные и не требуют никаких допущений ii о виде функции. Однако, найденные интерполяционные функции в интервалах между экспериментальными точками, очевидно, могут сильно отклоняться от истинных значений, особенно если имеется хотя бы небольшой разброс точек чтобы бороться с этим, предлагается использовать максимальное число стандартов различных концентраций , , . Точность.