Анализ сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных белков HU и p50 с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью универсального олигонуклеотидного микрочипа

• Автор: Заседателева, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ.
Введение

1. Литературный обзор.

Технологии ДНК матриц.

Применение ДНК микрочипов.

Анализ генной экспрессии.

Анализ точечного полиморфизма

Анализ специфичности ДНКбелкового взаимодействия

Белки и р

2. Материалы и методы.

Синтез олигонуклеотидов

Производство микрочипов
Белок .
Белок р
Условия гибридизации и снятие кривых диссоциации для белка . Условия гибридизации и снятие кривых диссоциации для белка р.
Измерение кривых диссоциации.
Анализ экспериментальных данных по взаимодействию р с
однонитевой и двунитевой ДНК с помощью отношения Фишера
гельэлектрофорез
Анализ сдвига электрофоретической подвижности .
3. Результаты.
Взаимодействие белков с однонитевыми олигонуклеотидами i
микрочипа
Специфичность взаимодействия белка II с однонитевыми
олигонуклеотидами
Специфичность взаимодействия белка р с однонитевыми
олигонуклеотидами
Взаимодействие белков с двунитевыми олигонуклеотидами i
микрочипа.
Специфичность взаимодействия белка с двунитевыми
олигонуклеотидами.
Специфичность взаимодействия белка р с двунитевыми
олигонуклеотидами.
Сопоставление результатов, полученных методом i микрочипа, с данными экспериментов по i электрофорезу с использованием двух мерных олигонуклеотидов, каждый из которых содержит 6мерный участок связывания белка
Специфичность связывания белка р с 4мерными участками У
4. Обсуждение
Выводы.
Благодарности
Список литературы


Успех проекта сиквенирования генома, который сам по себе явился результатом технологических усовершенствований и инноваций, делает необходимым дальнейшие технологические разработки по эффективному использованию огромного количества информации по сиквенированию. Функциональная геномика ответила развитием ряда новых технологий, и одной из наиболее эффективных стала технология биологических ДК микрочипов микроматриц. ДНК микрочип это очень точная, с высокой степенью плотности матрица однонитсвых олигонуклеотидых образцов, прикрепленных к твердой поверхности. Обычно, ДНК микрочипы изготовлены либо с использованием синтезированных олигонуклеотидов, либо на основе ПЦРамплифицированных последовательностей кДНК. Таким образом, каждая позиция в решетке микрочипа ячейка содержит много копий ДНК определенной последовательности. ДНК. Поэтому в основном ДНК микрочипы используют для анализа комплексных смесей из тысяч нуклотидных последовательностей на присутствие и количество молекул определенной последовательности. Способность качественно и количественно проанализировать смесь нуклеотидных последовательностей делает ДНК микрочипы чрезвычайно необходимой технологией с широкой областью применения. На сегодняшний день наиболее часто эта технология используется для анализа генной экспрессии и ДНК полиморфизма. Идентификация изменений в генной экспрессии, вызванных определенными воздействиями на организм иили связанных с изменениями в клетке в результате развития заболевания, долгое время была основной стратегией в исследовании физиологических путей. До недавнего времени анализ генной экспрессии в любом эксперименте был ограничен количественно несколькими десятками генов. Сейчас, с появлением ДНК микрочипов, стало возможным проводить анализ изменения экспрессии десятков тысяч различных генов в одном эксперименте. Технология ДНКмикрочипов позволила для определенных типов онкологических заболеваний выделить отдельные группы генов, которые имеют характерный уровень экспрессии, и, таким образом, расширить диагностику раковых заболеваний экспрессионным анализом. Вариации в геномной последовательности и структуре ответственны за большую часть вариаций среди индивидуумов. Знание генетической вариабельности между индивидуумами и корреляция этой информации с фенотипами болезней сыграло важную роль в понимании связи между генами и здоровьем человека. Помимо указанных основных областей применения, ДНК матрицы используются и для множества других целей. Таким образом, ДНК матрицы также используют для изучения ДНКбелкового взаимодейсвия. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Технологии ДНК матриц. ДНК матрицы последнее достижение в эволюции биоанапитических технологий, начало развития которых приходится на ые и ые годы. Появление ДНК матриц связано с возникновением идеи иммобилизации однонитевых последовательностей Д1Ж на твердой из пластика, стекла поверхности, а также на нитроцеллюлозных и нейлоновых мембранах. В основном используются три основных формата ДНК матриц, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки в цене, гибкости, вариабельности и простоты использования. Две технологии используют i i синтезированные олигонуклеотидные образцы, последовательности которых обычно берутся на основе последовательностей известных генов. Одна из этих технологий использует метод фотолитографии, адаптированный из микроэлектронной индустрии, для синтеза на поверхности стекла олигонуклеотидов длинной до оснований. Метод фотолитографии, используемый фирмой АГГутеЫх, позволяет производить микрочипы, на которых иммобилизовано ООО 0 0 олигонуклеотидов. I. Размер одной ячейки микрочипа АйутеПзх составляет x мкм. Размер самого микрочипа 1x1 см. Стоимость такого микрочипа составляет примерно . Рис. Микрочип фирмы АПутеепх. Основная стратегия этого метода заключается в следующем рис. Затем поверхность подложки заливается ЗОфосфорамидитактивированными дезоксинуклеозидами например, тимидин дезоксинуклеозид фосфорамидитами, защищенными по 5гидроксильному концу фотолабильной группой.