Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами

• Автор: Зенкин, Николай Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
i iЛ ЗЯМ6i

Цель работы и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность.

Структура и оьм работы.

. ли геря туры

1.1 Промоторы

1.2 асубъсдиницы

1.3 Структура холофермента.

1.4 Функции доменов асубъединицы

1.4.1. Район 1.
1.4.2. Район 2.
1.4.3. Районы 2.5 и
1.4.4. Район 4.
1.5 Детерминанты узнавания ДНК РНКнолимеразой.
1.5.1. Матрицы с одноцепочечными поли Зконцами i .
Гетеродуплексные матрицы
Промоторы с дефектами в двойной спирали
Одноцепочечные ДНК олигонуклеотиды.
Естественные гетеродуплексные промоторньте элементы участки начала репликации УНР некоторых плазмид и нитчатых бактериофагов
1.6 Абортивная инициация.
1.7 уть от узнавания промотора до ухода в элонгацию структу рная модель .
1.8 Диссоциация асубъединицы
1.9 Ьесфакторная регуляция транскрипции
1. Влияние конформации ДНК на силу промотора.
1. Взаимовлияние промоторов
2. Материалы и методы
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.2. Бактериальные среды.
2.3. Электрофорез
2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.5 Коньюгация бактерий
2.6 Заражение клеток бактериофагом М.
2.6 Белки
2.8 Приготовление а0субъединицы и фрагментов асубъединицы
2.9. Приготовление РНКполимеразы из клеток
2 Полимеразная цепная реакция ПЦР
2 Направленный ПЦРмутагенез.
2 Транскрипция i vi
. Транскрипция с V5 промотора.
. Транскрипция с Т7А1 промотора.
. Транскрипция на УНР М.
2. ДНКбелковая сшивка формальдегидом
2. Футпринтинг ДНКазой 1.
2. Аффинное мечение РНКП.
2. ДНКбелковая и белокбелковая сшивки в элонгационных комплексах
2. Расщепление РНК гидроксильными радикалами.
2. Гельфильтрация реакционных смесей после синтеза пРНК.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Изучение механизма воникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе V
3.1.1. Введение.
3.1.2. Комплекс в состоянии паузы является элонгационным, сдвинутым назад .
3.1.3. Пауза транскрипции в положении явление, зависящее от стсубъединицы.
3.1.4. Пауза транскрипции в положении возникает благодаря специфическому взаимодействию асубъединицы с ДНК.
3.1.5. Положение формальдегидной сшивки асубтединицы на ДНК.
3.1.6. оследовагельность района 2 асубъединицы важна для образования паузы
3.1.6. Детерминанты взаимодействия а субъединицы с корферментом в элонгационно.м комплексе.
3.1.7. Заключение
3.2 Изучение роли тсубъедииицы в синтезе РНКнолимеразой .i праймера для репликации генома бактериофага М.
3.2.1. Введение
3.2.2. Роль в узнавании УНР
3.2.3. Предполагаемые и районы УНР не играют роли в узнавании
3.2.4. стсубъединица необходима для синтеза пРНК, но не нужна для узнавания УНР
3.2.5. осубъединица важна на стадии синтеза тринуклеотида.
3.2.6. Роль района 3.2 стсубъединицы в транскрипции пРНК
3.2.7. Функция в синтезе пРНК является общей для факторов а1семейства
3.2.8. Место связывания шпильки УНР в корферменте
3.2.9. Заключение
3.3 Изучение механизма формирования РНКпраймера для репликации одноцепочечного генома бактериофага М.
3.3.1. Введение
3.3.2. Мосле остановки синтеза РНКполимераза продолжает быть связанной с РНК и ДНК, образуя необычный элонгационный комплекс.
3.3.3. Причина образования необычного элонгационного комплекса при
синтезе пРНК.
3.3.4. Расположение РНКДНК гибрида в РНКполимеразс.
3.3.5. Заключение
Выводы
Список сокращений
Список сокращений
Список литерату


Промотором называют участок ДНК, находящийся перед началом гранскрипционной единицы и ответственный за связывание и правильное позиционирование РНКполимеразы относительно точки начала транскрипции. Систематические исследования выявили консервативные элементы промоторов. Так называемыми базальными элементами промотора называются гексамсры, расположенные в районе положений и относительно точки начата транскрипции Рис. А, В. Сравнение большою количества промоторов, узнаваемых а холоферментом, дало возможность вывести консенсусные последовательности, соответствующие этим промоторным элементам Рис. А. Для мотива это ТАТААТ, для по нематричной цепи. Важным также оказалось и расстояние между этими элементами, находящееся в пределах пар оснований . Хотя оптимальные последовательности и элементов различны для разных стфакгоров, их расположение по отношению к старту транскрипции консервативно. Единственным исключением является ст промоторы, узнаваемые с помощью стхолофсрмента, имеют уникальную структуру , i . Узнавание и элементов промотора происходит за счет ДНКбслковых взаимодействий с эволюционно консервативными районами, соответственно, 2 и 4 стфактора . Примечательно, что сила промотора в большинстве случаев коррелирует со степенью сходства и элементов промотора с консенсусными последовательностями i . Д М II . Рис. Бактериальный промотор. Л Сравнение последовательностей 2 промоторов представлено в виде гистограммы, отражающей встречаемости каждого из оснований. Г1о , . В Схема промотора. Показаны удлиненный элемент, элемент и элемснт. Точка начала транскрипции обозначена, как а. Наиболее консервативные положения обозначены заглавными буквами. Кроме собственно последовательности и элементов, на силу промотора также оказывает влияние и их взаимное расположение. Оптимальным расстоянием между и элементами является величина пар оснований изменение расстояния в сторону как уменьшения, так и увеличения, ведет к ослаблению промотора . Кроме того, на силу промотора может влиять и последовательность участка между и элементами , . Важно отметить, что, в отличие от элемента, элемент не является абсолютно необходимым элементом промотора. Можно отметить несколько способов функциональной замены элемента, описанных к настоящему времени. В первом случае роль второго базального элемента промотора берез на себя дополнительный элемент промотора. Так промогор не содержит последовательности, близкой к элементу, вследствие чего взаимодействие РНКполимеразы с областью промогора в районе элемента не являегся необходимым для его узнавания , . В данном случае роль второго базального элемента промотора берет на себя дополнительный мотив , непосредственно прилегающие к элементу i , . Такой мотив был назван удлиненным . То, что удлиненный элемент является независимым промоторным элементом, подтверждается и тем, что в его узнавании принимает участие отдельный район фактора о эволюционно консервативный район 2. Вовторых, роль элемента промотора может играть белокрегулятор. Примером подобной системы может служить белок i, активирующий стзависимую транскрипцию средних промоторов бактериофага Г4 i, . И наконец, по крайней мере в одном описанном случае, для узнавания промотора второй базальный элемент может быть вовсе не нужен, стфактор , кодируемый бактериофагом Т4, не содержит района 4, отвечающего за взаимодействие с элементом. И хотя транкрипция поздних промоторов бактериофага холоферментом, содержащим , значительно стимулируется другими белками бактериофага и , узнавание промоторов может осуществляться и в отсугствие дополнительных белков исключительно за счет взаимодействия в составе холофермента с элементом i i, . Одним из свойств промоторов бактерий является их модульная организация. Так гибридный аафактор, содержащий район 2 фактора о и район 4 фактора ст, позволяет РНКполимеразе специфически узнавать гибридный промотор, содержащий элемент, узнаваемый с помощью ст0. Кроме базальных элементов, некоторые промоторы содержат дополнительные элементы, не являющиеся необходимымии для узнавания промотора, однако стимулирующие транскрипцию в отсутствие белковых факторов .