Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц

• Автор: Логунов, Денис Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурнофункциональная характеристика аденовируса

1.1.1. Общая характеристика аденовируса

1.1.2. Структурнофункциональная организация генома аденовируса

1.1.3. Структурные особенности вируса

1.2. Эукариотические векторы на оснозе генома аденовируса

птиц .

1.3. Опухолевый супрессор р.

1.3.1 Структурнофункциональная характеристика р
1.3.2. Биологическая роль гена р
1.3.3. Активация белка р
1.3.4. Мишени белка р.
1.3.5. Применение р в генной терапии
1.4. Аденовирусные векторы, экспрессирующие ген опухолевого
супрессора человека р
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидиые векторы.
2.1.4. Ферменты и другие реактивы.
2.1.5. Животные.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазам .
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза
в агарозном геле.
2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.7. Трансформация клеток . i
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.2.9. Полимеразная цепная реакция.
2.2 Синтез дезоксиолигонуклеотидов.
2.2 Трансфекция клеток лш1ии 3 или для получения рекомбинантных аденовирусов
2.2 Накопление вирусов.
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов
2.2 Титрование зирусоз.
2.2 Выделение вирионной ДНК
2.2 Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом. .
2.2 Определение авктивности секретируемой щелочной фосфатазы
2.2 Определение экспрессии галактозидазы i vi и в подкожных трансплантатах опухолей
2.2 Электрофорез белков в ПААГДСН
2.2 Иммуноблотинг I
2.2 Иммуноферментный анализ I .
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома 0 и генома аденовируса человека 5 серотила
3.2. Трансдукция клеточных культур.
3.2.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы i v.
3.3. Исследование векторной системы i viv.
3.3.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в пермиссивной
модели.
3.3.2. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в неперссивных
моделях
3.4. Исследование векторной системы , как геннотералевтического
агента.
3.4.1. Исследование влияния гуморального иммунного ответа на
уровень экспрессии целевых трансгенов при внутриопухолевых инъекциях вируса
3.4.2. Детекция экспрессии гена р в составе генома вектора
i vi.
3.4.3. Экспрессия гена в составе генома вектора i viv.
3.4.4. Ингибирование роста подкожных трансплантатах опухолей
вирусом
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ВВЕДЕНИЕ. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. . Опухолевый супрессор р. Мишени белка р. Глава 2. Плазмидиые векторы. Ферменты и другие реактивы. Животные. Методы. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазам . Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля. Трансформация клеток . Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Полимеразная цепная реакция. Синтез дезоксиолигонуклеотидов. Накопление вирусов. Титрование зирусоз. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом. Определение экспрессии Иммуноферментный анализ I . Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Трансдукция клеточных культур. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы i v. Исследование векторной системы i viv. i vi. Экспрессия гена в составе генома вектора i viv. Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. свободный от вирусной и бактериальной контаминации Экспрессию аденовирусных генов осуществляет ферментативный аппарат клеткихозяина, что позволило эффективно использовать аденовирусы для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и трансляции. На поздних стадиях инфекции происходит селективный синтез вирусных белков, в то время как трансляция мРКК клеткихозяина блокируется. Накоплены обширные знания о возможностях применения аденовирусов человека в качестве векторов для лечения заболеваний человека и животных. Широкая тропность, высокая пакующая емкость и способность расти в высоком титре определили преимущество аденовирусов над большинством других вирусных векторов. Значительное распространение получили аденовирусные зектсры на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ад5. Новой и перспективной представляется векторная система на основе аденовируса птиц 1 серотипа СЕЪО. Ад5. СЕЪО отдельно или последовательно с Ад5 для увеличения периода экспрессии целевых генов в организме человека. Важным достоинством СЕЪО является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах. Структурнофункциональная организация элементов капсида пентонов позволяет их направленную модификацию для повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток, что может быть значимо для практического применения вектора. В настоящее время опубликовано незначительное количество работ, посвященных изучению биологии вируса , и практически отсутствуют экспериментальные данные характеризующие поведение рекомбинантных вирусов i viv. В связи с чем, исследование основных характеристик иммуногенности, эффективности доставки целевых генов, времени экспрессии и др. в различных организмах представляет самостоятельный научный интерес. Целью настоящей работы являлось изучение векторной системы на основе аденовируса г. в различных животных моделях, с использованием генов и р. Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген или р под контролем Vпромотора в сайте делеции несущественной области генома .