Модификация отростка пентона аденовируса птиц CELO для получения вектора с измененным тропизмом, способного к эффективной трансдукции клеток млекопитающих

• Автор: Зубкова, Ольга Вадимовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика аденовирусов.

1.2. Строение пептона аденовируса человека 5го серотипа.

1.2.1. Проникновение аденовируса в клетки млекопитающих

1.2.2. Векторы на основе геномов аденовирусов человека.

1.2.3. Методы конструирования аденовирусных векторов с

альтернативным тропизмом.

1.3. Особенности структурнофункциональной организации аденовируса

птиц

1.3.1 Строение длинного фибера

1.3.2. Эукариотические векторы на основе аденовируса птиц
V
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.
2.1.2. Клеточные линии.
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Ферменты и другие реактивы
2.1.5. Лабораторные животные.
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Подготовка компетентных клеток .i штамма 5.
2.2.2. Подготовка компетентных клеток .i штамма .
2.2.3. Трансформация компетентных клеток .i штамма 5.
2.2.4. Трансформация компетентных клеток .i штамма
2.2.5. Гомологичная рекомбинация в клетках Б.соН
2.2.6. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.
2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.8. Рестрикционный анализ ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами.
2.2.9. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2 Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция ДНК из геля
2.2 Лигирование фрагментов ДНК
2.2 Идентификация рекомбинантных клонов.
2.2 Полимеразная цепная реакция.
2.2 ПНР в режиме реального времени
2.2 Выделение тотальной РНК из культуры клеток
2.2 Реакция обратной транскрипции.
2.2 Выделение тотальной ДНК.
2.2 Трансфекция культур клеток методом липофекции.
2.2 Получение рекомбинантных аденовирусов.
2.2 Накопление вирусов
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов СЕГО
2.2 Выделение вирусной ДНК
2.2 Титрование вирусов
2.2 Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы.
2.2 Иммуноферментный анализ.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Идентификация т бШсо участков аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера вируса СЕГО пригодных для модификации вирусного тропизма
3.2. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц , несущих последовательность в глобулярном домене длинного отростка пентона .
3.2.1. Создание плазмидной конструкции, несущей последовательность на Сконцс глобулярного домена длинного фибера аденовируса птиц
3.2.2. Создание плазмидной конструкции, несущей последовательность в Шпетле глобулярного домена длинного фибера аденовируса птиц
3.2.3. Создание плазмидных конструкций, содержащих полноразмерный геном аденовируса птиц С и несущих последовательность в глобулярном домене длинного фибера
3.2.4. Создание плазмидных конструкций, несущих полноразмерный геном аденовируса птиц с модифицированным фибером и репортерными генами.
3.2.5. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц с модифицированным фибером
3.3. Исследование функциональной активности модифицированных векторов в экспериментах i vi.
3.3.1. Анализ экспрессии и интегринов на клеточной поверхности различных клеток млекопитающих
3.3.2. Трансдукция различных линий клеток млекопитающих модифицированными рекомбинантными аденовирусами и 1 i vi.
3.3.3. Изучение механизма проникновения модифицированного 1 вектора в клетки млекопитающих
3.3.4. Исследование влияния последовательности на проникновение модифицированного вектора в клетки млекопитающих.
3.4. Исследование эффективности доставки генов, встроенных в геном модифицированного I вектора в экспериментах i viv
3.4.1. Определение эффективности доставки секретируемой щелочной фосфатазы модифицированным вектором I в дефицитные мышечные клетки
3.4.2. Определение эффективности доставки репортерного гена модифицированным вектором I в клетки молочной железы кролика
3.5. Определение эффективности доставки гена лактоферрина человека модифицированным вектором I в клетки молочной железы i
vi и i viv.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Векторы наоснове геномаАд5 обладают рядом неоспоримых преимуществ, к которым относятся широкая тропность, способность расти в высоком титре и безопасность. В тоже время следует отметить ряд недостатков этой векторной системы, в частности, недостаточная пакующая емкость, высокая себестоимость препаратов рекомбинантных Ад, предсущесгвующий иммунный ответ в, организме человека. В связи с этим большой интерес вызывает возможность создания новых векторных систем на основе геномов аденовирусов гггиц лишенных этих недостатков. Вирус имеет типичную для всех аденовирусов икосаэдрическую форму капсида, который состоит из капсомеров гексона и пептона, диаметр вириона составляет нм. Геном Ад представлен линейной двухцепочечиой молекулой ДНК. Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием у него ряда преимуществ по сравнению с векторами на основе генома Ад человека. Капсид аденовируса обладает большей пакующей емкость и физической стабильностью но сравнению с капсидами аденовирусов человека. Кроме этого, Ад не способен к репликации в клетках млекопитающих, то есть является по отношению к таким клеткам репликативнодефектным. Недавние исследования показали, что вирус может быть использован в качестве вектора для доставки генетической информации в генной терапии и вакцинации. Однако в этих же исследованиях было показано, что практическое применение векторов на основе является ограниченным для определенных типов клеток млекопитающих, вследствие недостаточной эффективности их трансдукции. Традиционно для решения проблем, связанных с низкой эффективностью трансдукции клеток млекопитающих векторами на основе Ад человека, используются подходы, связанные с генетической модификацией отростка пентона фибера. Данные подходы реализуются посредством конструирования химерных фиберовзамена глобулярного домена на соответствующий домен альтернативного серотипа Ад или введения различных гетсрологичных рецепторсвязывающих последовательностей на Сконец или в Шпетлю глобулярного домена фибера. Векторы с модифицированными фиберами способны обеспечивать эффективную доставку генетической информации в определенные клетки млекопитающих, в норме резистентные к Ад инфекции. В отличие от Ад5, в каждой вершине вириона находится два фибера различной длины. Длинный фибер способен к взаимодействию с основным аденовирусным рецептором xi vi , и, в отличие, от короткого фибера несущественен для сборки и проникновения вируса в пермиссивные клетки. В связи с этим исследования, связанные с созданием фибермодифицированных векторов , способных к эффективной доставке генетической информации в клетки млекопитающих, представляют самостоятельный научный интерес. Идентификация участков в аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера вируса , пригодных для модификации вирусного тропизма. Vпромотора. Определение эффективности доставки генетической информации модифицированными векторами в экспериментах по трансдукции различных культур клеток. Изучение механизма проникновения модифицированных векторов в клетки млекопитающих. Определение эффективности доставки рспортерного гена , встроенного в геном модифицированных векторов в дефицитные клетки млекопитающих в экспериментах i viv. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В результате проведенной работы впервые идентифицирована Iпепии в аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера аденовируса птиц . Впервые получены векторы т основе аденовируса птиц , содержащиепоследовательность в структуре длинного фибера, и несущие репортерные гены или под контролем V промотора I, I, и Показано, что введение интефинсвязывающей последовательности в Шпетлкг глобулярного домена длинного, фибера не влияет на исходные функции данного белка, не снижает способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах и приводит к изменению тропизма вируса. Впервые показан независимый механизм трансдукции клеток, млекопитающих модифицированным вектором I Определено увеличение процессов прикрепления и интернализации вектора I в клетки млекопитающих.