Биосенсоры на основе тканевых препаратов моноаминоксидазы и ацетилхолинэстеразы

• Автор: Ковалева, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 109 с.

Оглавление

Принятые сокращения

Введение.

Обзор литературы

1. Биосенсоры. Общая характеристика

2. Биосенсоры для определения ингибиторов МАО

2.1. Общая характеристика фермента.

2.2. Антидепрессанты ингибиторы МАО.

2.3. Ферментсодержащие препараты для МАОбиосенсоров

2.4. Потенциометрические биосенсоры.

2.5. Амперометрические биосеисоры.

2.6. Биосенсоры с другими регистрирующими системами.
3. Биосенсоры для определения ингибиторов АХЭ.
3.1. Общая характеристика фермента
3.2. Ингибиторы АХЭ.
3.3. Ферментсодержащие препараты для АХЭбиосенсоров
3.4. Потенциометрические биосенсоры.
3.5. Амперометрические биосенсоры.
3.6. Биосенсоры с другими регистрирующими системами.
3.7. Биосенсор на основе АХЭ из растительного источника.
4. Тестсистемы и тестметоды.
Заключение
Материалы и методы.
1. Метод получения тканевых ферментных препаратов.
1.1. Приготовление ферментного препарата с активностью МАО
.2. Приготовление ферментного препарата с активностью АХЭ.
2. Биохимический анализ активности ферментов
2.1. Определение активности МАО.
2.2. Определение активности АХЭ.
3. Методы работы с биогестами.
3.1. Выявление активности МАО.
3.2. Контрольные эксперименты.
3.3. Изучение ингибиторов МАО
3.3.1. Исследование специфических и неспецифических ингибиторов МАО.
3.3.2. Исследование влияния фиксаторов на активность МАО в биотесте.
3.4. Выявление активности АХЭ
3.4.1. Ферриферроцианидная реакция.
3.4.2. Ферриферроцианидная реакция с диаминобензидином.
3.5. Контрольные эксперименты
3.6. Исследование ингибиторов АХЭ
4. Методы количественного анализа биотестов.
4.1. Регистрация спектров отражения
4.2. Расчет коэффициентов отражения
4.3. Метод телевизионной компьютерной фотометрии.
4.4. Особенности метода телевизионной компьютерной фотометрии
Результаты и их обсуждение
I. Биотесты на основе тканевых препаратов МАО
1.Технологии изготовления МАОбиотестов
1.1. Иммобилизация ферментного препарата в матрицу.
1.2. Технология изготовления биотеста на основе срезов ткани печени
2. Характеристики биотестов
2.1. Определение активности МАО в МАОбиотесте.
2.2. Кинетика образования формазана в МЛОбиотесте.
2.3. Оценка прочности связывания ферментного препарата МАО с матрицей
2.4. Активность МАО в биотестах при хранении.
3. Исследование субстратной специфичности МАОбиотеста.
3.1. Чувствительность МАОбиотеста к различным моноаминам
3.2. Влияние ингибитора ипрониазила на чувствительность МАОбиотеста к моноаминам.
4. Исследование антидепрессантов и других ингибиторов МАО
5. Анализ действия химических фиксаторов на активность МАО.
Обсуждение.
Заключение.
II. Биотесты на основе тканевых препаратов АХЭ.
1.Технологии изготовления АХЭбиогестов
1.1. Выбор ткани для АХЭбиотеста
1.2. Иммобилизация ферментного препарата в матрицу
1.3. Технология изготовления АХЭбиотеста на основе срезов хвостатого.ядра.
2. Характеристики АХЭбиотеста
2.1. Определение активности АХЭ в лиофилизованиом гомогенате мозга крыс
2.2. Кинетика образования ферроцианида меди в АХЭбиотесте
2.3. Усиление ферриферроциа.чидной реакции.
2.4. Активность АХЭ в биотсстах при хранении
2.5. Исследование ингибирования активности АХЭ в биотесте эзерином и прозерино.м
2.6. Определение различных ингибиторов и плацебо при помощи АХЭ биотеста
Обсуждение
Список цитированной литературы


Биосенсорные устройства электроды, в которых применяются неочищенные ферменты ферментные препараты в виде срезов тканей, гомогенатов, клеточных культур в литературе называются тканевьши биосенсорами и имеют ряд достоинств и недостатков i, , . Из достоинств можно отметить следующие отсутствует необходимость проводить выделение и очистку требуемых ферментов ферменты и кофакторы в тканевых препаратах находятся в естественном иммобилизованном состоянии, что особенно важно, в случае мембранносвязанных ферментов, и в естественном биохимическом окружении, влияющем на активность ферментов, вследствие чего возможно увеличение длительности жизни тканевого ферментного препарата в активном состоянии уникальное сочетание в клетках различных ферментных систем и кофакторов расширяет круг определяемых веществ природная локализация и взаимосвязь ферментных систем в клетках и тканях обеспечивает их активность и стабильность. Эти достоинства дают возможность значительно снижать стоимость анализаторов без потери их остальных качеств за счет использования неочищенных ферментных препаратов и увеличения срока использования биосенсора. Однако у тканевых биосенсоров есть и недостатки в ряде случаев низкая селективность, обусловленная присутствием в ферментных препаратах ряда ферментов, которые могут катализировать побочные реакции. Ивницкий, . Если в тканевом материале протекают вышеуказанные побочные процессы, разрабатываются специальные меры по увеличению избирательности создания оптимума температуры к для данного фермента, добавление кофакторов и т. Область разработки биосенсорных систем развивается в настоящее время по двум направлениям. Это конструирование сложных высокоточных приборов для определения различных веществ и направление создания простых, доступных и относительно дешевых биосенсорных устройств, чувствительных тестсистем для лабораторных и полевых условий с возможностью количественной оценки реакции таких биосенсорных систем на анализируемые соединения. Интерес исследователей к ферментам моноаминоксидазе КФ 1. МАО и ацетилхолинэстеразе КФ 3. АХЭ не случаен. МАО и АХЭ являются ключевыми ферментами нервной системы. Эти ферменты имеют уникально широкий круг ингибиторов, которые используются в медицинской практике первые, как антидепрессанты, а вторые для лечения болезни Альцгеймера, миастении, глаукомы и т. Кроме этого, ингибиторами АХЭ являются фосфорорганическис и карбаматные пестициды, используемые з сельском хозяйстве и в быту поверхностноактивные вещества, соли тяжелых металлов и потому, необходимы простые методы экологического мониторинга окружающей среды. Имеющиеся различные методы определения ингибиторов МАО и АХЭ фармакологические, биохимические, физиологические и др. В этой связи актуальной является задача разработки упрощенных тестовых методов определения ингибиторов МАО и АХЭ, предназначенных для обнаружения и количественной оценки этих соединений. Целью работы явилось создание простых биосенсорных устройств в виде бумажных биотесгов с оптическим способом детекции на основе тканевых ферментных препаратов с высокой активностью МАО и АХЭ. Исследовать каталитические свойства МАО и АХЭ в условиях Ы vi, в частности, активность ферментов в тканевых гомогенатах, поведение ферментов в процессе иммобилизации в бумажную матрицу. Провести анализ основных характеристик разработанных биотестов чувствительность, активность ферментов в биогестах. Разработать способы детекции взаимодействия биотсстов с анализируемыми соединениями. Разработать методику обнаружения и определения ингибиторов вышеуказанных ферментов при помощи данных биотсстов. Как отмечалось выше, биосенсор состоит из двух функциональных элементов чувствительного биологического элемента и физического преобразователя сигнала. Взаимодействие определяемого вещества и биологического элемента приводит к изменению физикохимических параметров биомагериала, регистрация которых осуществляется преобразователем Будников, рис. Биосенсоры. Рис. Типы биологических компонентов и физических преобразователей в сенсорах.